补骨脂主要成分的肝毒性比较研究.docxVIP

补骨脂主要成分的肝毒性比较研究 补骨脂是一种含有30ml以上科可可氏合金的干燥成熟果实。温肾助阳、益气平喘、温脾泻药的功效。广泛使用。中药补骨脂有30多种被用于中药。尽管药典中并无关于补骨脂毒性的记载, 然而关于补骨脂的肝脏毒性自从2005年来开始受到关注, 2005年和2009年分别有关于补骨脂及其相关制剂引起肝毒性的临床报道 前期研究推测补骨脂素和异补骨脂素可能有肝毒性 本文考察了补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚对体外Hep G2细胞的细胞毒性和小鼠的肝毒性, 并检测了口服补骨脂生药粉后动物血液和肝脏中补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚的浓度。 1 动物、饮料和仪器 补骨脂药材, 湖北黄冈市金新龙中药饮片有限公司, 经检测其中一些主要成分含量分别是补骨脂苷为1.431%, 异补骨脂苷为1.166%, 补骨脂素为0.420%, 异补骨脂素为0.400%, 补骨脂酚为6.406%。 补骨脂素、异补骨脂素、氯霉素的标准品购自中国食品药品检定研究院;补骨脂酚标准品购自四川成都西亚试剂。动物实验使用补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚 (经HPLC检测纯度95%) 购自天津市月牙湖科技有限公司。 胎牛血清 (FBS) 、DMEM高糖培养基、0.25%胰酶、青链霉素双抗 (美国GIBCO) ;MTT (美国Sigma) ;天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 、谷氨酸氨基转移酶 (ALT) 、碱性磷酸酶 (ALP) 检测试剂盒 (中国, 中生北控) ;BCA蛋白测定试剂盒 (美国Thermo) ;注射用大豆油 (中国, 浙江田雨山药用油有限公司) ;生理盐水 (中国, 辰欣药业) 。 Thermo Stratos和Legend Micro17离心机 (美国Thermo公司) ;Enspire多功能读板机 (美国Perkin Elmer公司) ;7020全自动生化仪 (日本Hitachi公司) ;脱水机、切片机均 (德国LECIA公司) ;光学显微镜 (日本OLYMPUS公司) ;AE200S电子分析天平 (上海梅特勒-托利多仪器有限公司) 。 2 大鼠的给药、解剖和病理组织学检测 Hep G2细胞于DMEM全培基 (含10%的FBS、1%双抗) , 置于37℃、5%CO Hep G2细胞按0.5×10 ICR小鼠, 雌雄各半, 随机分为对照组、助溶剂 (西黄蓍胶) 组、溶剂 (注射用大豆油) 组、补骨脂素80 mg/kg组、异补骨脂素80 mg/kg组和补骨脂酚80 mg/kg组, 每组10只。补骨脂素和异补骨脂素用受试药5%量的西黄蓍胶助溶, 溶解于生理盐水中;补骨脂酚的溶剂为注射用大豆油。腹腔注射给药20 ml/kg体重, 每天给药1次, 连续4周。给药期结束, 所有动物麻醉后取血、分离血清, 全自动生化仪检测AST、ALT和ALP;解剖取肝脏并计算肝系数, 取一叶肝脏用10%甲醛固定, 脱水后石蜡包埋、切片后HE染色, 病理组织学检查在光学显微镜下进行。 SD大鼠随机分组, 分为对照组和补骨脂单次给药组和补骨脂给药3个月组, 每组10只, 雌雄各半。给药剂量为灌胃补骨脂生药粉末3 g/kg。补骨脂单次给药组大鼠在给药后24 h处死动物, 取血和肝脏;补骨脂给药3个月组, 在连续给药3个月后, 于末次药后24 h处死动物, 取血和肝脏。取材前均禁食不禁水12 h, 麻醉后腹主动脉取血。 补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚的检测方法根据前期研究 表格中数据以均数±标准差表示, 图中数据以均数±标准误差表示, 组间比较采用单因素方差分析, SPSS版本为20.0。 3 助溶剂和溶剂对小鼠肝生化指标和病理组织学检查的影响 三个成分在体外培养的Hep G2细胞上作用24 h, 随着药物浓度的提高都可表现出一定细胞毒性, 细胞活力降低与药物浓度相关。补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚在400μmol/L浓度下的相对细胞活力分别为57.5%、66.5%和6.0%, 在25μmol/L浓度下的相对细胞活力分别为93.6%、93.2%和83.1%, 然而补骨脂酚在12.5μmol/L剂量时细胞相对活力高于100%, 在多次重复实验中可见该现象 (见图1B) 。依照本实验数据补骨脂素和异补骨脂素无法计算其对Hep G2细胞的IC 结果表明, 助溶剂和溶剂对小鼠的体重、肝脏中、肝系数、血清AST、ALT和ALP均无显著影响。与助溶剂组相比较, 异补骨脂素组小鼠体重显著降低, 且肝脏重量也显著下降;而补骨脂素组小鼠肝脏显著增大。补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚均可引起小鼠肝系数显著升高 (见表1) 。补骨脂素组小鼠ALP显著降低;异补骨脂素组小鼠血清AST和ALT显著升高, 而ALP显著降低 (见表2) 。 病理组织学检查发现, 补骨脂素组小鼠肝脏内可见散在局灶性坏死, 但对照