DB23-T1278-2008奶牛、肉牛体外胚胎生产操作技术规程.pdf

ICS 65. 020.30B 43DB23备案号：黑龙江省地方标准DB23/T /x奶牛、肉牛体外胚胎生产操作技术规程-≥发布大实施黑龙江省质量技术监督局发布 DB23/T ×××xXXXX言本标准由黑龙江省畜妆兽医局提山。本标准由黑龙江省畜牧标准化技术委员会归口。本标准起草单位：黑龙江省农业科学院畜牧研究中心。本标准主要起草人：·刘娣、马红。 DB23/T ×××XXXX丙酮酸钠0.137青霉素0. 075链霉素0. 050.BO-A液(获能液)：30毫升BO液加0.0583g咖啡因BO-B液(受精液)：3毫升BO液加0.06gBSA和100单位的肝素按所配制溶液的配方，称量配制溶液各种基本成分的含革，用超纯净水溶解，使用市售的带有0.22μm~0.45μm孔径滤膜的过滤除菌器过滤除菌，混均后放置于4℃保存，保存期不宜超过两个月。在使用前4h置于培养箱中预热，中35mm培养IⅢ分别制成50μ1培养滴，加石蜡油覆盖，置丁培养箱中预平衡。-D. 5胚胎培养液（SOF液）表D.5主要成分g/LNaci58.30KC!5. 34KH-PO.1. 62MgS0.. 7H209.10Na-Lac6.16NaCO,21.01丙酮酸钠0. 36CaCl22. 62按所配制溶液的配方，称最配制溶液各种基本成分的含量，用超纯净水溶解，使用市售的带有0.22μm~0.45μm孔径滤膜的过滤除菌器过滤除菌，混均后放置于-4℃保存，保存期不宜超过两个月。在使用前4h置于培养箱中预热，用中35mm培养皿分别制成50μ培养滴，加有蜡油覆盖，置于培养箱中预平衡。D.6饲养层细胞培养液DMEM/F12+10%FBS直接使用市售成品溶液，或者将市售粉末制剂成品根据说明用纯水溶解，使用市售的带有0.22μm~0.45μm孔径滤膜的过滤除菌器过滤除菌，然后添加血清混均后放置于4℃保存，保存期不宜超过两个月。 DB23/T ×××x-IXXXX奶牛、肉牛体外胚胎生产操作技术规程1范围本标准规定了奶牛、肉牛体外胚胎生产前准备、卵母细胞收集、卵母细胞体外成熟、精液准备、体外受精、胚胎体外培养技术耍求。本标推适用于奶牛、肉牛的体外胚胎的生产。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB4143XX牛冷冻精液3　术语和定义下列术语利定义适用丁本标准3.1极体在卵子发生过程中，初级卵母细胞和次级卵母细胞减数分裂均为不均等分裂，分别产生一个小细胞利个几乎拥有所有细胞质成分的大细胞，对其小细胞分别称为第一极体和第二极体。3.2精子获能是指精子在若干生殖道获能因子在获能液的作用下，获得受精能力的过程。3. 3卵母细胞体外成熟从卵泡中取出的卵丹细胞在体外成熟培养液中培养完成第一次减数分裂达到第二次减数分裂中期的过程。3. 4受精卵精子与卵母细胞结合形成合子称为受精卵。3.5卵裂受精卵早期的分裂过程称为卵裂。3.6桑椹胚受精卵卵裂为16个细胞以上，卵裂球堆积成形成桑棋状，这个时期的胚胎称为桑椹胚。3. 7翼胚桑椹胚发育到一定时期胚胎发育形成有腔阶段称为囊胚。3.8体外受精 DB23/T ×××精子和卵子置丁适宜的培养条件下使之宪成受精的过程，称为体外受精。4实验室和仪器设备4.1实验室准备次，并用强度为1W/m的紫外灯照射，照射时间为60min。在体外胚胎生产开始前对无菌室空气进行紫外线消毒，照射时间为30min。4.2仪器设备4.2.1二氧化碳培养箱使用前二氧化碳培养箱参数设置为39℃，5%CO2和饱和湿度平衡24h以上。4.2.2超净台使用前打开紫外灯对操作台面和将要在超净台中使用的具和器血进行表面灭菌，时间为20min。4.2.3加热板，恒温箱，水浴锅使用前1h打开仪器调整温度到37℃并保持温度恒定。4.2.4其他仪器离心机、液氮罐、生物显微镜、实体显微镜、相差显微镜、微量移液器。5实验前准备5.1器具的清洗和消毒灭菌5.1.1器具的清洗选用碱性洗涤剂清洗普通器具，对于培养器具，应使用中性洗涤剂或者使用一次性器具。5.1.2器具消毒灭菌对于可以重复使用的器皿，根据其类型的不同采干燥灭菌法、高压蒸汽灭菌法或煮沸消毒法。5.2培养液的制备、灭菌及实验前准备5.2.1操作液和培养液的制备药液参考配方利配置保存方法见附录D。6体外生产胚胎的基本程序6.1卵母细胞采集及体外成熟6.1.1供体选择标准挑选体格健壮、无任何疾病、米妊娠、卵巢形态正常的母牛作为供体。6.1.2卵母细胞的采集6.1.2.1离体卵巢卵母细胞的采集从屠宰的母牛体内取山卵巢，将其放入装有37℃生理盐水的保温瓶内，在3h内运回实验室。6.1.2.1.1抽吸法用 12号的注射器