目的基因的获得.pptVIP

第三节 目的基因的获得 目前克隆目的基因常用的方法有四种方法：PCR法、RT-PCR法、CDNA文库法和化学合成法 。一、PCR法PCR法用来克隆原核基因和不带内含子的真核基因。 PCR的含义 聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 PCR的基本原理试管中进行的DNA复制反应，依据DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。 PCR的反应过程预变性：使模板DNA的二级结构充分打开，让DNA双链充分解离,为了第一次退火过程时候引物可以尽量多的结合到模板上面。 一般的PCR反应的预变性温度是94℃或95℃，预变性时间一般设为3-5 min。 PCR的反应过程变性：使DNA双链解离变为单链。一般94℃～95℃，1min足以使模板变性若低于94℃则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 PCR的反应过程退火(复性)：使引物结合在模板上。退火温度是影响PCR特异性的重要因素。退火温度，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，一般在40-65 ℃之间。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想。 引物的复性温度的计算公式Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值－（5～10℃）； 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性；复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合。 PCR的反应过程延伸：在DNA聚合酶的催化下，按照碱基互补配对原则不断合成DNA片段。延伸温度：一般选择在70～75℃之间常用温度为72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min扩增10kb需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 PCR的反应过程演示 待扩增片段 高温变性 低温退火 中温延伸 PCR法克隆基因的技术流程设计引物提取基因组DNA进行PCR反应进行电泳检测 设计引物引物设计的原则：（1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。 设计引物（6）引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）， 5’端无严格限制。（7）引物5′端可修饰 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。 3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记 提取基因组DNA模板DNA的来源：微生物中提取DNA植物中提取DNA从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化模板DNA的浓度： 0.1～2ug/100ul体系PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加 进行PCR反应 PCR 反应体系与流程反应体系模板（DNA或RNA）引物Taq DNA聚合酶10×PCR缓冲液1.5～4 mM Mg2+0.2 mM dNTP反应流程预变性变性退火延伸延伸完全终止25～35循环 进行电泳检测电泳检测：对PCR的结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。（例如下面是VvSUC11基因的电泳结果） 二 RT-PCR法RT-PCR的定义：是将RNA的反转录（ reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性和半定量分析的最有效方法。 RT-PCR的过程 试管内逆转录反应 RT-PCR结果的电泳检测例如下面是基因VvSUC11和VvSUC12的RT-PCR结果： 三 CDNA文库法基因文库(gene library):将生物材料的基因组 DNA或cDNA片段化，然后与特定的载体连接导入