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火炬松ssr-pcr反应体系优化 经过广泛的引进和栽培，火炬松（ustaeda）产于美国东南部，生长迅速，树干形状笔直而完美，木材质量好，松脂产量高，适应性强。它在世界上许多国家和地区都被广泛引入和种植，成为重要的速生建筑和纸浆材料树种。我国于上世纪30年代引种火炬松,现已成为33°N以南、海拔500 m以下亚热带低山、丘陵、岗地重要的用材林和原料林树种,是我国引种的国外松中表现较好的一个树种。目前,国内对火炬松的研究集中在遗传变异研究 SSR标记具有重复性好、多态性高、共显性等特点,是开展分子标记辅助育种和研究群体遗传多样性的有力工具。本研究拟采用单因素试验及正交试验设计建立火炬松SSR-PCR扩增反应的优化体系,以便下一步开展火炬松SSR标记遗传多样性研究。 1 材料和方法 1.1 松第1代树种 试验材料采自湖南省汩罗县白水苗圃火炬松第1代种子园半同胞家系苗木。野外采集的幼嫩针叶装入盛有硅胶的自封袋中,干燥之后置于-70℃冰箱中保存备用。 1.2 试剂和提取物 SSR-PCR扩增反应所用试剂均采购于天根生化科技有限公司。SSR引物来自Auckland等 1.3 测试方法 1.3.1 提取和检测各组dna 选取火炬松健康幼叶、采用改良的CTAB法 1.3.2 sr-pcr扩增 SSR-PCR反应体系和扩增程序参考文献 1.3.3 试验设计 根据基础反应体系,改变其中一个因素,其余因素保持不变,设计5因素5水平单因素试验。DNA模板、引物、d NTPs、Mg 1.3.4 加热温度 在优化反应体系的基础上,根据引物的解链温度(Tm)设置6个水平的退火温度梯度,每个梯度降低1℃,确定引物的最佳退火温度。 1.3.5 pcr产物检测 PCR反应扩增的产物用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,150 V恒压、50 m A电流,时间5~10 h,银染法染色,拍照保存。 1.3.6 最合适反应系统的评估和引用 用优化后的SSR-PCR反应体系对火炬松样本进行扩增,以验证其稳定性,并利用优化体系从60对引物中筛选条带清晰、多态性丰富的引物对。 2 结果与分析 2.1 火炬松组的dna浓度和纯度 用Eppendorf Bio photometer核酸蛋白分析仪测定提取的火炬松样本DNA浓度与纯度,其OD 2.2 单因素试验 2.2.1 dna模板浓度 在一定范围内,DNA模板浓度越高,目的序列的扩增量越大,但如果模板浓度过高在电泳检测时会出现条带弥散的现象。不同DNA模板浓度对SSR-PCR扩增效果的影响如图2所示。随着DNA模板用量的增加,扩增产物也随之增加,DNA模板用量为80 ng和90 ng时条带清晰明亮。 2.2.2 引物浓度的影响 引物浓度较低时扩增产物少,条带较暗;浓度较高时促进非特异性扩增,有引物二聚体产生。不同引物浓度对SSR-PCR扩增效果的影响如图2所示。由图2可知,不同水平的引物浓度扩增效果差异不显著,适当增加各水平之间的浓度差扩增效果差异显著,浓度为0.3μmol/L时条带最好。 2.2.3 dnps浓度 d NTPs是PCR反应的底物,浓度过低直接影响扩增条带的亮度;d NTPs分子中的磷酸基团可与Mg 2.2.4 Mg Mg 2.2.5 浓度对非特异性产品的影响 Taq酶是PCR反应的催化剂,浓度过低靶序列产量降低,浓度过高会导致非特异性产物增加。不同Taq酶浓度对SSR-PCR扩增效果的影响如图2所示。当Taq酶浓度为0.75 U时条带较好。 2.3 引物及dntps浓度 根据单因素试验结果,设定DNA模板用量为70~90 ng,引物浓度为0.1~0.3μmol/L,d NTPs浓度为0.20~0.30 mmol/L,Mg 2.4 道16退火温度对26条带的影响 退火温度对SSR-PCR扩增效果的影响如图4所示。引物为Pt TX3013,泳道1~6退火温度依次为53、52、51、50、49、48℃。由图4可知,6个温度梯度均能扩增出清晰的条带,随着退火温度的降低条带亮度逐渐减弱,说明适当地提高退火温度可增加扩增产物。因此,引物Pt TX3013的最适退火温度确定为53℃。 2.5 pcr扩增结果 利用优化后的最佳反应体系对火炬松39个样本进行SSR-PCR扩增,结果如图5所示。所有样本均能扩增出清晰明亮的条带,说明所得反应体系及程序扩增效果较好,结果稳定可靠,可用于火炬松育种群体SSR标记遗传多样性研究。 3 最佳反应体系的确定 SSR-PCR扩增反应受DNA模板、引物、d NTPs、Mg 本研究采用单因素试验及正交试验设计,优化建立了火炬松SSR-PCR的最佳反应体系:模板DNA 80 ng,引物0.3μmol/L,d NTPs 0.20 mmol/L,Mg 根据优化结果,对文献