高中生物课件：备课素材：PCR定点突变技术-2023高二下学期生物人教版选择性必修3.ppt

PCR定点突变技术 先看一道试题： 通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5’端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述正确的是（ ） A. 在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、Taq酶等 B. 第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因 C. 引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入运载体 D. 第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2 答案：C 解析：PCR的原理是DNA双链复制，步骤包括高温变性、复性、延伸。该过程需要耐高温的DNA聚合酶催化，需要四种游离的脱氧核苷酸做原料。 在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、Taq酶等，不需要解旋酶，利用高温引起双链解旋的，A错误；第2轮PCR，引物1能与图中②结合但形成的DNA两条链长度不同，B错误；引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入运载体，避免发生自身环化，C正确；第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，占2/8=1/4，D错误。因此，本题答案选C。 这道试题提到了PCR技术的应用——基因定点突变，教材中没有涉及。 那么，什么是PCR技术基因定点突变？ PCR定点突变技术是最常用的基因定点突变技术，通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中。PCR定点突变技术具有突变回收率高、可在任何位点引入突变、材料和试剂容易获得、操作简单等优点，它又可以分为重叠延伸PCR、大引物PCR等。 1.重叠延伸PCR 重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术。如图3-9所示，该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。 2.大引物PCR 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图3-10所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 例1、PCR介导的基因定点突变，下列说法正确的是 A.能用双链DNA作为模板，可以在任何位点引入突变 B.不需要进行突变体回收 C.快速简便，无需在噬菌体M13载体上进行分子克隆 D.可在同一试管中完成所有反应 答案：ACD 例2、关于关于重组PCR定点突变法叙述正确的是（） A . 增加镁离子浓度容易产生正向突变 B . 第一轮PCR扩增的是不同DNA模版链 C . 第二轮PCR扩增的是同一DNA模板链 D . 第三轮PCR需要两种外侧寡核苷酸引物进行扩增E . 该方法产生的DNA片段需要经过测序来验证是否发生其他突变 答案：BD