第十二讲 文库的构建.pptVIP

②随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) 根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。 在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。 当前第31页\共有46页\编于星期三\11点 4.3 第二链cDNA的合成 cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA:cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。 cDNA第二链的合成的方法大致4种： 　自身引导合成法 置换合成法 引导合成法 引物－衔接头合成法 当前第32页\共有46页\编于星期三\11点 ①自身引导合成法 获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。 当前第33页\共有46页\编于星期三\11点 基因组文库和cDNA文库的构建 当前第1页\共有46页\编于星期三\11点 第一节 基因组文库的构建 1 基因组文库(genomielibrary): 将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。 作用：获得特定基因。 当前第2页\共有46页\编于星期三\11点 2 基因组文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库 噬菌体文库 黏粒文库 人工染色体文库 当前第3页\共有46页\编于星期三\11点 3 构建基因组文库应满足的条件 3.1 文库的完整性 要包含基因组的完整序列信息，通过产生一系列一定大小、覆盖全基因组的DNA片段的重组克隆来实现。 当前第4页\共有46页\编于星期三\11点 限制性内切酶 …… 克隆、转化、培养、鉴定 基因组DNA 基因组文库 当前第5页\共有46页\编于星期三\11点 3.2 基因组信息的可重建性 通过建立叠连群(contig)重建完整序列信息。 当前第6页\共有46页\编于星期三\11点 3.3 文库的大小 即文库中应包含的独立重组子数。 一般来说，DNA片段长，完整基因组文库所含的克隆数越少。反之，越多。 基因组越大，文库应包含的克隆数越多，反之，越少。 当前第7页\共有46页\编于星期三\11点 4 基因组文库的质量标准 一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆； 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序； 克隆片段易于从载体分子上完整卸下； 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。 当前第8页\共有46页\编于星期三\11点 5 基因组DNA文库构建的程序 (噬菌体基因组文库的构建) ⑴基因组DNA的分离制备 不同来源的DNA制备方法不同。 一般来说，有液相法和固相法两种。 液相法提取的DNA长度一般在100kb左右，基本可以满足构建各种小插入片段基因组文库的要求。 当前第9页\共有46页\编于星期三\11点 大相对分子质量(high molecular weight,HMW)基因组DNA的提取方法 当前第10页\共有46页\编于星期三\11点 当前第11页\共有46页\编于星期三\11点 ⑵基因组DNA的片段化 ①酶切 部分酶切的主要目的是产生随机性的DNA片段用于构建基因组文库。 ②DNA分子的物理剪切 DNA溶液的小孔喷射 超声波处理 高速搅拌 当前第12页\共有46页\编于星期三\11点 ⑶载体的制备 要求： 载体的去磷酸化处理 载体的纯度 当前第13页\共有46页\编于星期三\11点 ⑷重组连接 按照连接酶催化反应的最适条件设置反应体系，同时还应通过预备性实验确立反应体系具体的参数。 当前第14页\共有46页\编于星期三\11点 ⑸噬菌体离体包装 ⑹重组噬菌体感染大肠杆菌 当前第15页\共有46页\编于星期三\11点 6 基因组文库的扩增筛选 ⑴文库的扩增 基于噬菌体载体的基因组文库通过感