DB37_T 4032-2020非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山長东省地方标准DB37/T4032—2020非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范Technical specification for isothermal amplification detection of African swine fever2020-07-09发布2020-08-09实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 4032—2020附录D（规范性附录）英文缩路表英文缩略表见表D.1.表D.1英文缩略表英文缩写英文全称中文名ASFVAfrican swine fever virus丰洲猪癌病毒RPAReconbinase polynerase anplification重组酶聚合酶扩增PBSphosphate buffer saline磷酸缓冲盐溶液DEPCdiethyl pyrocarbonate焦碳酸二乙酯PCRPolynerase Chain Reaction聚合酶链式反应7 DB37/T 4032—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院备牧兽医研究所、山东师范大学、中国动物卫生与流行病学中心、山东鼎科检测技术有限公司、雕坊安普未来生物科技有限公司、上海基灵生物科技有限公司、潍坊汉森生物饲科科技有限公司。本标准主要起草人：孙文博、吴家强、陈蕾、股斌、陈智、吴晓东、蒋文明、刘国宪、郑乾坤、李、杜以军、于江、时建立、吴香菊、李俊、丛晓燕、郭立辉。 DB37/T 4032——2020非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范1范围本标准规定了非洲猪癌病毒（ASFV），英文缩略表见附录D，核酸的重组酶聚合酶扩增（RPA）检测技术的要求本标准适用于非洲猪癌的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3原理核酸恒温扩增技术是依赖解旋醇解开双链DNA，依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下开始扩增。4试剂或材料除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。4.1水：GB/T 6682，—级水.4.21×PBS溶液(pH值7.4)：配制见附录A.1。4.3核酸提取试剂：a)蛋白酶K溶液（20mg/mL）：配制见附录A.2；b)10%十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）：配制见附录A.3：c)Tris 平衡酚：d)三氯甲烷：70%乙醇：配制见附录A.4.4.4重组醇聚合酶恒温扩增试剂盒。4.5 DEPC 水。4.6恒温扩增检测的引物：恒温扩增检测引物见附永B.1。4.7无水乙醇。4.8微量移液器配套的带滤芯吸头。4.9离心管：1.5 mL。55主要器设备 DB37/T4032—20205.1微量移液器：最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL。5. 2生物安全柜。5. 3普通冰箱。5. 4涡旋振荡器。5.5研磨管。5. 6荧光定量PCR仪：Peltier加热，≥16孔（0.2mL，2×8联管和单管）。5. 7电子天平：感量为0.001g.5. 8低温高速台式离心机：离心力≥8000g。6样品6. 1基本要求应符合GB19489—2008和NY/T541—2016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输的要求。6.2样品采集6.2.1棉拭子样品无菌操作，采集猪口腔拭子。6.2.2组织样品无菌操作，取猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2C8℃低温运至实验室。6.2.3环境样品相关场所的类便、饲料、污水样品。2℃～8C低温运至实验室。6.3样品处理6. 3.1口腔拭子样品处理口腔拭子管6000r/min震荡45s，取200μL进行核酸提取。6.3.2脾、肺、臀等组织样品处理取0.05g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000r/min震荡研磨45s，制成约10%的组织匀浆液，5000g离心5min，取200μL上清液进行核酸提取。6.3.3粪便、饲料样品处理取1g粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6000r/min震荡研磨45S，制成约10%的匀浆液，5000g离心5min，取200μL上清液进行核酸提取。6.3.4污水样品处理取200μL污水进行核酸提取。7操作步骤 DB37/T 4032—20207. 1取6.2处理后的样品500μL加入10%SDS溶液50μL、20mg/ml蛋白酶K溶液10μL