SCT 7205.3-2007牡蛎包纳米虫病诊断规程 第3部分：透射电镜诊断法.pdf

ICS 65.020.30B 41SC中华人民共和国水产行业标准SC/T 7205.3—2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第3部分：透射电镜诊断法Diagnostic Protocols for Bonamiosis of Oyster-Part 3: Transmission Electron Microscopy Method2007-09~14发布2007-12-01实施中华人民共和国农业部发布 SC/T 7205.32007前 言SC/T7205《牡蛎包纳米虫病诊断规程》分为三个部分：-第1部分：组织印片的细胞学诊断法；-第2部分：组织病理学诊断法；第3部分：透射电镜诊断法。本部分为SC/T7205的第3部分。本部分的附录A为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳出人境检验检疫局。本部分主要起草人：杨冰、黄健、陈爱平、江育林、王崇明、王秀华、魏琦、刘莉。 SC/T 7205.3—2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第3部分：透射电镜诊断法1 范围SC/T7205的本部分规定了牡蛎包纳米虫病透射电镜诊断法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分适用于对疑似包纳米虫病样品的确诊和组织细胞的超微病理学评价。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SC/T7205.1一2007.牡蛎包纳米虫病诊断规程．第1部分：组织印片的细胞学诊断法3原理3.1牡蛎包纳米虫及其病理学特征见SC/T7205.1—2007(牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法）中3.1的规定。3.2技术原理通过透射电镜观察被检组织超微结构，分辩包纳米虫的精细形态，从而确诊被检样品是否感染包纳米虫。4试剂和材料4.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。4.2 海水。4.3无水乙醇。4.4.95%乙醇。4.5环氧树脂(Epon812)4.6环氧丙烷。4.7氧化丙烯。4.8合成树脂。4.9碱性甲苯胺蓝（Toluidine blue)：生物染色剂。4.1070%乙醇按附录A的规定。4.113%戊二醛按附录A的规定。4.12.1%钱酸按附录A的规定。4.13Epon-812包埋剂配方按附录:A的规定。4.14柠檬酸铅染色液配方按附录A的规定。 SC/T 7205.3—20074.15醋酸铀染色液配方按附录A的规定。5仪器设备5.1电子显微镜。5.2超薄切片机。5.3铜网。5.4载玻片。5.5盖玻片。5.6解剖刀。5.7镊子。6操作步骤6.1固定组织块6.1.1样品的采集要求见SC/T7205.1---2007(牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法)附录B。6.1.2对于电镜观察的组织块，重要的是正确地进行固定以使超微结构尽可能少受到破坏。把样品切成大小不超过3mm~4mm的小块，以使固定液迅速渗透样品中。6.1.3用3%戊二醛固定样品1h（4℃），固定时间过长会导致膜状结构变形，再用经0.22um滤膜过滤的海水洗3次，1%的饿酸固定（1h），再用过滤的海水洗2次。6.2脱水和包埋6.2.1脱水：样品浸入一系列不同浓度的乙醇中脱水：70%乙醇1次（15min），95%乙醇2次（各15min），无水乙醇3次（各10min），无水乙醇：环氧丙烷(1:1）1次。最后换2次环氧丙烷（各15min)完成脱水过程。6.2.2样品逐步漫透：首先将样品置于氧化丙烯一环氧树脂50/50（V/V)的混合物中，再放人环氧树脂中。浸泡的时间越长，组织块被浸透得越好(1d左右）。6.2.3包埋：将样品置于盛满环氧树脂的模具中进行包埋。在每个模块上做好标记，然后在60℃下作用48 h。6.3切片和复染6.3.1先用刀片把树脂块切成适当大小，然后用超薄切片机切片。先切一些0.5um～1um的半薄切片放在载玻片上。这些切片用光镜检查以控制样品的质量，并通过它们找到切片上值得注意的区域。这些半薄切片于90℃~100℃下用1%（碱性）甲苯胺蓝染液染色，染色后加一滴合成树脂用盖玻片封片，在光镜下观察。6.3.2在超薄切片机上切取80mm~100nm厚的超薄切片，捞取到铜网上，用醋酸铀和柠檬酸铅复染超薄切片。6.4透射电镜观察7结果判定7.1致死包纳米虫（Bonamiaexitiosus）的原生质形态大小为4.0μm4.5μum，其细胞和细胞核的轮廓不规则，无定形的细胞质包含体