SC_T 7219.6-2015三代虫病诊断规程 第6部分：小林三代虫病.pdf

ICS 65.020.30B 50SC中华人民共和国水产行业标准SC/T 7219.6—2015三代虫病诊断规程第6部分：小林三代虫病Protocols for diagnosis of Gyrodactylosis-Part 6: Infection with Gyrodactylus kobayashi2015-02-09 发布2015-05-01实施中华人民共和国农业部发布 SC/T 7219. 6—2015前言SC/T 7219《三代虫病诊断规程》为系列标准：第1部分：大西洋鲑三代虫病;第2部分：鲩三代虫病；一-第3部分：鲢三代虫病；—第 4 部分:中型三代虫病;一第5部分：细锚三代虫病;-第6部分：小林三代虫病；本部分为SC/T 7219的第6部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部渔业渔政管理局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。本部分起草单位：中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站。本部分主要起草人：李文祥、王桂堂、邹红、吴山功、陈爱平。I SC/T 7219. 6—2015三代虫病诊断规程第6部分：小林三代虫病1 范围本部分规定了小林三代虫病的感染对象与临床症状，小林三代虫（Gyrodactylus kobayashii)的采集与固定、形态学鉴定和分子检测的方法以及小林三代虫病的综合判定。本部分适用于鲫的小林三代虫病的流行病学调查、诊断、监测和检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3试剂和材料3.1水：符合GB/T 6682中一级水的规定。3.2 乙醇：分析纯。3.3Taq酶：20℃保存,避免反复冻融。3. 4 dNTPs:含 dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 10 mmol/L。3.5上游引物:5- TTTCCGTAGGTGAACCT-3。3.6下游引物:5-TCCTCCGCTTAGTGATA-3。3.7 矿物油:不含 DNA酶和 RNA 酶。3. 8 DNA marker 2 000:2 000 bp 、1 000 bp.750 bp、500 bp、250 bp、100 bp。3.9 其他试剂见附录 A。4仪器和设备4.1解剖盘、剪刀、镊子、解剖针、手术刀。4.2体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。4.3盖玻片、载玻片、培养皿。4.4电子天平。4.5普通台式离心机和高速冷冻离心机。4.6普通冰箱和超低温冰箱。4.7微量移液器。4.8PCR扩增仪。4.9离心管和 PCR管。4.10紫外透射仪。4.11水平电泳系统。1 SC/T 7219. 6—20155 感染对象与临床症状5.1感染对象小林三代虫能感染鲫(Carassius auratus auratus）和东北雅罗鱼(Leuciscus aleckii）等。5. 2 临床症状小林三代虫主要寄生于体表，病鱼常出现蹭擦池壁、跃出水面的行为；有些病鱼反应迟钝.常在水流缓慢的地方出现，体表因黏液增多变成淡灰色，背鳍、尾鳍和胸鳍的边缘出现糜烂。6三代虫采集与固定6.1病鱼采集仔细观察待检鱼类的临床症状和行为，捞取具有典型症状的鱼类。采样方法、样品数量、样品封存和运输应符合 SC/T 7103的规定。6.2三代虫样品的收集6.2.1现场采集剪取鳍条、鳃丝或刮取部分体表黏液，置于载玻片上。滴加数滴清水，置于体视显微镜下观察。用解剖针将三代虫从鳍条或鳃丝或体表黏液中分离，用吸管吸出，放在盛有清水的培养皿中，每尾病鱼至少采集成虫10条。6.2.2固定病鱼中的采集剪取病鱼鳍条或鳃丝放在载玻片上，逐滴加入自来水浸泡10min，置于体视显微镜下观察。发现三代虫后，用解剖针将虫体分离，放在盛有清水的培养皿中；同时，镜检固定病鱼所用容器底部的沉淀物。如发现有从鱼体脱落的三代虫，用吸管吸出，放在盛有清水的培养皿中。6.3三代虫样品的固定与保存加一滴清水到载玻片上，用吸管吸取一个虫体置于水滴中，轻轻地盖上盖玻片。用一张滤纸在盖玻片边缘缓慢吸水，直到水基本吸干为止。加上一滴APG溶液（见附录A.1)到盖玻片边缘，直到浸满盖玻片与载玻片之间的空隙。用于形态学鉴定的虫体样本可用70%酒精保存，用于PCR鉴定的虫体样品可用95%酒精保存。7小林三代虫的鉴定7.1小林三代虫的形态学鉴定小林三代虫运动如尺；虫体呈长叶形，体长0.3mm～0.7mm，体前有2个头器，无黑色眼点；虫体后端具几丁质的伞状后吸器，其上有1对锚钩