SN_T 2627-2010马铃薯卷叶病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2627—2010马铃薯卷叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of potato leafroll virus for quarantine2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 +散码防痧 SN/T 2627—2010前 言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、四川省农业厅植物检疫站、四川农业大学。本标准主要起草人：孟兴、宁红、张洪峰、张敏、谭家兴、郭迪金、吴婕。1 SN/T2627—2010马铃薯卷叶病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了进境植物检疫中马铃薯卷叶病毒检测鉴定的程序。本标适用于马铃薯块茎、种苗等茄科植物感染马铃薯卷叶病毒的检验和鉴定。2原理马铃薯卷叶病毒（potatoleafrllvirus.PLRV）属马铃薯黄症病毒科，马铃薯卷叶病毒属。病毒粒体球状，粒体直径23nm～25nm，是等轴对称癌牵。致死温度℃，稀释限点约10-^。引起马铃薯卷叶病毒病。马铃薯病毒病一般根据病害症状很难确定病毒种类,采用免疫学和分子生物学方法，可快速根据有关判断标准进行马铃葬卷叶病毒检疫鉴定。3试剂与材料除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分板纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。3.1免疫学检验试剂3.1.1捕捉抗体（(Captureantibody)马铃薯卷呀病毒免疫球蛋白抗体稀释度按市售产品要求进行。储藏于4℃条件下备用。ate)：碱性磷酸酶标记的马铃薯卷叶病毒的免3.1.2酶标抗体（Alkalinephophataseeenzynteconju疫球蛋白抗体。按市售产品要求进行稀释，储鼓于4条件下备用。3. 1.3包被缓冲液(Coating bhffer） 2.9g碳酸氢钠(NHCO:、1.59 g 碳酸钠(NazCO）、0.2 g叠氮化钠(NaN），用1000ml.蒸馏水溶,并调pH值到.6,储激等4℃条件下备用。3.1.4洗涤液（PBSTBuffer）)：最1.15g无水磷酸氢二钠NaHPU）、0.2g氯化钾（KC1)、0.2g无水磷酸二氢钾(KH2PO.）、8.0g氯化钠(NaCl)、0.5,吐温-20,用1,000mL蒸馏水溶解，并调整pH值到7.4。3.1.5样品提取液（GEBbuffer）：取1.3g无水硫酸钠（Na2SO）、20.0g聚乙烯吡咯烷酮E(C,H,NO)24~400o］、0.2g叠氮化钠（NaNs）、2.0gⅡI级鸡蛋清白蛋白粉、20.0g吐温-20，用1000mL洗涤液溶解，并调整pH值到7.4，储藏于4℃条件下备用，3.1.6酶标抗体稀释缓冲液（ECIBuffer）：取0.2g牛血清白蛋白（或脱脂奶粉）、2.0g聚乙烯吡咯烷酮(CHNO),J、0.02g叠氮化钠(NaNs），用100ml.洗涤缓冲液溶解，并调整pH值到7.4，储藏于4℃条件下备用。3.1.7底物缀冲液（PNPBuffer）：用:80ml灭菌蒸馏水将0.01g氮化镁（MgClz）、0.02g叠氮化钠（NaNs）、9.7mL二已醇胺(CHCHzOH)溶解后，用盐酸调pH值到9.8定容到100mL，储藏于4℃条件下备用。3.1.8底物溶液（PNPsubstate)：将5mg对硝基苯磷酸盐（CHsNOs）溶解于5mL底物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前15min内，避光条件下制备。3.1.9终止液：12g氢氧化钠(NaOH)溶于100ml.蒸馏水。1 SN/T 2627—20103.2RT-PCR检验试剂3.2.1莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(MMLV)：100U/iL。3.2.21XTAE缓冲液：40mmol/LTris-HCl,20mmol/L乙酸钠，2mmol/LEDTA(用冰乙酸调pH至8.0)。3.2.35×RT缓冲液（5×RTBuffer)：50mmol/LTris-HClpH7.5,100mmol/I.氯化钠，0.1mmol/LEDTA,10 mmol/L DTT,0.01% NP-40,50%甘油。3.2.410×PCR缓冲液：100mmol/LTris-HCl（pH8.3）,500mmol/1.氯化钾。3.2.5多氯化镁：25mmol/L。3.2.6RNA酶抑制剂(RNasin):10U/μL。3.2.7RT增强剂(RTEhancer)。3.2.8无水乙醇（CHCHzOH）。3.2.9RI裂解液。3.2.10去蛋白液。3.2.11Tag 酶:2. 5 U/μL。3.2.12dNTPMixture10mmol/L.3.2.13漂洗液。3.2.14双蒸水（ddH2O)。3.2