NY_T 2258-2012香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2258—2012香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范Molecular detection for pathogen of banana black leaf streak disease2012-12-07 发布2013-03-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T2258—2012前言本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由农业部农垦局提出。本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所本标准主要起草人：谢艺贤、漆艳香、张欣、蒲金基、张贺、陆英、张辉强。 NY/T2258—2012香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范1范围本标准规定了香蕉黑条叶斑病原菌（MycosphaerellafijiensisMorelet)分子检测方法。本标准适用于香蕉种苗及大田植株上的黑条叶斑病原菌的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括围B修改单）适用于本文件。ISHINGSN/T1193基因国分析检测实验率度术要TANDAR3术语和定义下列术语和义诺RES3. 1香蕉黑条叶斑疗Ognana black afureak disease(Mycos由斐济球laerellae引起的种为害香计的检疫性真菌病害。该病害病原菌的类地等主范围地理分布及ARO为害症状见A4A.6A3. 2内转泉核糖体基因内间隔区ribosomal DNA internal transcribed spacers,TS糖体基因内转真核生物核（DNA-ITS通常包括ITSI.5.8-3.3聚合酶链式反应polymerasechain reaction,PCRO先经模板基因序经高温变性成为单链：在DNA聚合酶作用和道竹，根据模板序列设马模板DNA两计的两条引物分别序列发生退火而工相结合条链上相应的，接着在DNA聚合互不酶的作用下以四种底物，使引断重复变性、退火和延伸这-一循环，使欲扩增的ERK4原理(-DNA-根据香蕉黑条叶斑病原菌核糖体基因内转录间隔区ITS）特减基序列设计特异性引物进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期10099bp的DNA片段，判断构中是否携带香蕉黑条叶斑病原菌。5仪器设备及试剂见B.1和B.2。6取样按附录A描述的症状仔细检查香蕉叶片，发现香蕉黑条叶斑病疑似症状，即取叶片200g以上，装入牛皮纸袋中，送实验室检测。显微观察从疑似病样病斑上挑取或用透明胶粘取灰色霉状物制成临时玻片进行镜检，观察有无类似斐济球1 NY/T2258—2012腔菌的分生孢子存在。8PCR检测8.1PCR反应模板制备见 B.4. 1。8.2PCR反应在PCR薄壁管中分别加人以下试剂（25μL体系）后进行PCR反应：1μL基因组DNA，10XPCR缓冲液（Mg+Plus)2.5μL，脱氧核糖核苷酸（dNTP)混合物2μL，特异性引物（见表1)各0.5μL，Taq酶0.2μL，无菌超纯水18.3。表1PCR反应的引物及扩增产物引物名称预期扩增产物引物序列MF1375-GGCGCCCCCGGAGGCCGTCTA-31 009 bpR6355-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3反应条件：94℃预变性3min；后30个循环为94℃变性45s至60s62℃退火45s至60s；72℃延伸1min；最后72℃延伸5min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存，存放时间不超过24h。8.3反应体系中对照的设置8.3.1阳性对照用香蕉黑条叶斑病原菌基因组DNA作为模板。8.3.2样品对照用健康香蕉组培苗提取的基因组DNA作为模板8.3.3PCR反应体系对照用配制反应体系的无菌超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染。8.4PCR产物凝胶电泳检测8.4.1凝胶制备见B.4.2。8.4.2加样与电泳见B.4.3。8.5凝胶成像分析将整块琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪系统观察窗内，根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，并拍照保存，参见图1。8.6防污染措施检测过程中防污染措施按照SN/T1193中的规定执行。9结果判定9.1PCR反应体系正常与否判定如果样品对照或PCR反应体系对照出现目的条带，或阳性对照未出现目的扩增条带，表明PCR反应体系工作不正常，样品检测结果不能作为结果判定的依据，需重新准备PCR试剂和阳性对照，并重新进行样品的PCR检测，具体操作按照8.2～8.6的规定执行，如果阳性对照出现目的扩增条带，而样品对照和PCR反应体系对照均不出现该条带，表明PCR反应体系正常，样品PCR检测结果可以作为结果判定的依据。2 NY/T