SN 1474-2004传染性造血器官坏死病毒逆转录聚合酶链式反应操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1474—2004传染性造血器官坏死病毒逆转录聚合酶链式反应操作规程Protocol of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)for infectious haematopoietic necrosis virus2004-11-17 发布2005-04-01 实施中华人民共和国发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1474—2004前言本标准的附录 A为规范性附录,附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高隆英、刘、史秀杰、江育林。本标推系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1474—2004传染性造血器官坏死病毒逆转录聚合酶链式反应操作规程1范围本标准规定了用逆转录聚合酶链式反应技术检测传染性造血器官坏死病毒的方法。本标准适用于鱼类传染性造血器官坏死病的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样3试剂和材料3.1IHNV标准毒株：由 OIE参考实验室或国家质量监督检验检疫局、农业部等有关部门指定提供。3.2水：试剂配制（见附录A）用水应符合GB6682中级水的规格，并要用DEPC处理，除去RNA酶。3.3Taq酶：一20℃保存，避免温度剧烈变化。3.4AMV逆转录酶：一20℃保存，避免温度剧烈变化。3.5RNA酶抑制剂：一20℃保存，避免温度剧烈变化。3.6 dNTP(含 dCTP,dGTP.dATP、dTTP 各 10 mmoL/L)。3.7引物:所选取的基因为 IHNV 的 N基因(参见附录 B)中的片段,两对引物,浓度为 40 μmol/I,F1和R1扩增该基因中的786bp片断，而F2和R2则从786bp片断中再扩增323bp片断。上游引物 R1:5-TCA-AGG-GGG-GAG-TCC-TCG-A-3’，下游引物 F1:5-CAC-CGT-ACT-TTG-CTG-CTA-C-3,上游弓物 R2 5-TTC-GCA-GAT-CCC-AAC-AAC-AA-3,下游引物 F2 5-GCG-CAC-AGT-GCC-TTG-GCT-3。3.8无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。4仪器和设备PCR扩增仪、电泳仪、紫外透射仪、普通冰箱、低温冰箱、台式离心机、电子天平、高速冷冻离心机、微量移液器及吸头、恒温培养箱、电动勾浆器、剪刀、镊子、离心管和PCR管。5操作方法5.1采样对鱼的解剖取样，如果是体长小于 4 cm 的鱼苗取整条鱼，4 cm～6 cm 的鱼苗取内脏（包括肾）;体长大于6cm的鱼则取脑、肝、肾、脾。成熟雌鱼还需取卵巢液。而鱼的采样数量见GB/T18088。5.2RNA抽提将取得的组织放人1.5mL的离心管中，用眼科剪刀先将样品剪碎，然后加人150μLCTAB溶液（见第A.1章)用匀浆器将样品匀浆成糊状，再将CTAB溶液补加至900uL，混匀，25℃作用2.5h。 SN/T 1474—2004加入600μL抽提液Ⅱ（酚-三氯甲烷-异戊醇）（见第A.3章），充分混合不少于30s。12000r/min离心5min，取上层水相（约800 μL）。再加人700μL抽提液I（三氯甲烷-异戊醇)（见第A.2章），充分混合不少于30s。12000r/min离心5min，取上层水相（约600μL）。再加人一20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇（约900μL），充分混匀后，一20℃8h以上沉淀核酸。12000r/min离心30min，小心弃去上清，放人干燥箱干燥，干燥后加人10uL经DEPC处理过的水，溶解后作为RT-PCR模板溶液。5.3变性和退火在PCR管中加人10μL模板溶液和2.5μL引物R1,加2.5μL水使总体积为15μL。置于70℃反应 5 min。立即冰浴，低速离心约 5 s,将液体收集在底部。5.4　cDNA 合成在5.3反应管中继续加人：5 μuL的 5倍逆转录酶浓缩缓冲液（5×buffer)（见第 A.5章）、2 μuLdNTP、0.5 μL RNA酶抑制剂(20IU)、1 μL逆转录酶 AMV(10 IU)和1.5μL水，总体积为 25μL。42℃ 60 min反应以合成模板的cDNA。5.5 PCR 扩增 DNA在5.4反应管中再继续加入：10倍Taq酶用浓缩