质粒提取试剂盒中各溶液配方及作用(强碱裂解法).docVIP

质粒提取试剂盒中各溶液配方及作用 溶液Ⅰ（P1） 组分浓度 25 mM Tris-HCl（pH8.0），10 mM EDTA，50 mM 葡萄糖（Glucose） 溶液Ⅰ组分 主要作用是将菌体沉淀悬浮起来 组分类型 组分作用 25 mM Tris-HCl（pH8.0） 缓冲液 保证反应体系的pH恒定 10 mM EDTA 金属离子螯合剂 与微生物体内的金属离子相互结合，抑制DNase的活性 50 mM 葡萄糖 / 增加溶液的粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体沉降的时间 RNA酶（RNase A） 酶 降解掉溶液中的RNA 备注：溶液Ⅰ在使用前通常要加入RNA酶（RNase A），由于RNA酶属于蛋白质，蛋白质稳定性很差，所以加了RNase A的溶液Ⅰ需要低温4℃保存。 溶液Ⅱ（P2） 组分浓度 250 mM NaOH，1％（W/V）SDS（十二烷基硫酸钠）。 溶液Ⅱ组分 主要作用是细胞裂解 组分类型 组分作用 250 mM NaOH / 氢氧化钠会破坏细胞膜的结构，使之发生bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化，从而导致细胞的裂解。 1％（W/V）SDS（十二烷基硫酸钠） / 十二烷基硫酸钠(SDS)很容易与蛋白质结合，平均两个氨基酸就会结合一个SDS分子，二者结合会形成SDS2多肽复合体，这样变性蛋白质将溶解在溶液中，从而使得多肽链更好地与基因组DNA缠绕。 备注：（1）时间一定不能过长；（2）不可以剧烈震动离心管。 时间过长以及剧烈震动都将导致氢氧化钠破坏基因组DNA，断裂的基因组DNA碎片将会与相似大小质粒一同被抽提，污染样品。 溶液Ⅲ（N3） 组分浓度 3M 醋酸钾（potassium acetate），5M 醋酸。 溶液Ⅲ组分 主要作用：（1）中和第二步加入的强碱； （2）清除掉蛋白质等细胞内的杂质。 组分类型 组分作用 5M 醋酸 / 中和氢氧化钠 3M 醋酸钾 / 十二烷基硫酸盐与变性蛋白质结合成复合体，十二烷基硫酸钾的沉淀就将变性的蛋白质一起沉淀，同时变性的蛋白质与基因组DNA缠绕，结果也大部分被共沉淀了。而高离子浓度的溶液又加速了这一沉淀过程。此外，溶液被中和后变性蛋白质表面电荷减少，也可以促进变性蛋白质沉淀。 备注：（1）强碱溶液氢氧化钠长时间与DNA接触会破坏其结构，因此需要进行中和。 溶液PE （wash buffer） 组分浓度10 mM Tris-HCl （pH 7.5）， 80 %乙醇（Ethanol） wash buffer 主要作用：清洗掉多余的盐离子 备注：试剂盒中都是利用硅胶柱进行DNA提取的。在DNA与硅胶柱吸附后，需要利用Wash buffer清洗掉多余的盐离子。Wash buffer中含有高浓度的乙醇，由于乙醇会影响后续的酶切或测序反应，在洗脱DNA前必须要在离心机内”空甩”柱子，完全清除掉乙醇。 溶液EB（Elution buffer） 组分浓度10 mM Tris-HCl （pH 7.5） Elution buffer 洗脱硅胶柱上的DNA样品 备注：（1）Elution buffer中不能含有过高浓度的盐离子，因为在高盐环境中，盐阳离子会打破硅胶负氧根和水之间的氢键，使得整体的硅胶携带正电，会吸引携带负电的DNA分子。 （2）加热过的洗脱液（50°C）可以加速DNA从硅胶膜上脱离下来 （3）离心前保持EB缓冲液在膜上停留时间长一些，将更有利于DNA的洗脱。 不同公司的质粒提取试剂盒中溶液成分可能有所差异。