SN_T 3676-2013甘蔗低凋萎病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3676---2013甘蔗凋萎病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Gibberella sacchari Summerell et Leslie2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T3676—2013前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘跃庭、崔铁军、罗加凤、刘鹏、廖芳、张裕君。1 SN/T3676—2013甘蔗凋萎病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了甘蔗调萎病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于甘蔗种子、植株中甘燕凋萎病菌的检疫鉴定。2甘蔗凋萎病菌基本信息中文名：甘蔗调菱病菌学名:Gibberella sacchari Summerell et Leslie无性态：Fusariumsacchari(E.J.Butler)W.Gams分类地位：甘蔗萎病菌属真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），子囊菌纲（Ascomycetes），粪壳菌亚纲（Sordariomycetidae）、肉座菌目（Hypocreales），肉座菌科（Hypocreaceae），赤霉菌属（Gibberella）。无性态为Fusariumsacchari（E.J.Butler）W.Gams，属丝孢菌纲（Hyphomycetes），丛梗孢目（Monilales），瘤座孢科（Tuberculariaceae），镰刀菌属（Fusaium）。传播途径：病菌依靠带菌种子、种苗和病残体进行远距离传播。甘蔗调萎病菌的其他信息参见附录A。3方法原理病原菌的为害症状、分离培养性状、形态特征作为甘燕调萎病菌的检疫鉴定依据。41仪器设备和主要试剂4.1仪器设备培养Ⅲ（直径90mm100mm）、三角瓶、镊子、手术剪、手术刀、接种针、棉纱、脱脂棉、酒精灯。体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平、高压灭菌锅、常规冰箱（一20℃）、超低温冰箱（-70℃）。4.2主要试剂马铃薯、胡萝卜、番茄、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素、乳酸、1.0%次氯酸钠（NaC1O）。5鉴定方法5.1症状检查5.1.1甘蔗种子挑选畸形、瘦小等可疑种子进行分离培养。1 SN/T3676—20135.1.2甘蔗繁殖茎将甘燕繁殖茎横切和纵切，检查燕茎是否变色（参见附录A），对变色的可疑材料进行分离培养。5.2病原菌的分离培养5.2.1培养基的制备马铃薯培养基（PDA）、胡萝卜培养基（CA）、麝香石竹叶培养基（CILA）、V8-汁培养基的制备参见附录B。5.2.2病原菌的分离培养甘蔗种子中病原菌的分离培养将甘蔗种子放入1.0%的次氯酸钠溶液中，消薪5min，灭菌水冲洗3次，用灭荫滤纸吸干水分后。置于PDA培养基平板上，每Ⅲ放置20～30粒，25℃～30℃.12h光照黑暗交替培养。培养3d后开始观察，发现乳灰白色可疑菌落，转接到CLA培养基平板上诱导大型分生孢子产生，紫外线能促进大型分生孢子产生；可疑菌落转接到CA或V8-汁培养基上诱导子囊壳的产生。培养3d后开始观察.记录菌落培养性状，观察大、小分生孢子和子囊壳的产生·在显微镜下观察并测量大、小分生孢子、子凳壳和子囊孢子的形状及大小。甘蔗繁殖茎中病原菌的分离培养挑选出的甘燕材料剪成0.4cm×0.4cm小块，用纱布包好，放入1.0%的次氮酸钠溶液，消毒5min，灭菌水冲洗3次，用灭菌滤纸吸于水分后，置手PDA培养基平板上，每I放置3～4块，培养方法同。6鉴定特征6.1培养性状在.PDA培养基上菌丝大量垒长，开始灰白色，随时间逐渐变为紫色，培养6d～10d后菌落中产生分生孢子。在PDA上菌落边缘不整齐，生长较缓慢，生长速度约3.9mm/d，气生菌丝纤细。（参见图C.1）6.2形态特征有性态：子囊壳表生，青紫色，倒卵形，有疣状突起，表面粗糙。子囊梭形，开裂.内有子凳孢子8个。直径250um～390μm（平均310um），有侧丝。子壳在3%的氢氧化钾溶液中不变色，在100%的乳酸中变成红色。子囊壳由分区明显的内外两层构成，外层厚18um39um（平均30.6um）.内层厚4.4μm～5.9um（平均4.9μm），外层细胞大，内层细胞小。子袭孢子从孢子角溢出，光滑，透明.椭圆形或倒卵形，两端钝圆，0～1个分隔，一般为1个分隔，分隔处稍缢缩，子囊孢子大小（281m～321m）×（3um～4.5um）（平均30.4um×4.2μm）。子囊壳和子囊孢子的大小是鉴定甘燕调萎病菌的重要特征（参见图C.2），甘燕凋萎病菌与近似种的区别参见附录D。无性态：大型分生孢子（38μm~6