SNT 1996-2007贝类中腹泻性贝类毒素检验方法 酶连免疫吸附法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1996-—2007贝类中腹泻性贝类毒素检验方法酶联免疫吸附法Determination of diarrhetic shellfish poison in shellfish-ELISA method2007-12-24发布2008-07-01实施中华人民共和·国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1996—2007言前本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：于兵、曹际娟、高世光、麻丽丹、金东权、谢琰、李丽、孙杰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1996—2007贝类中腹泻性贝类毒素检验方法酶联免疫吸附法范围本标准规定了腹泻性贝类毒素检验的抽样、制样和酶联免疫检验方法。本标准适用于海产双壳类可食用部分的腹泻性贝类毒素的检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN0294出口贝类腹泻性贝类毒素检验方法3定义、术语和缩略语3.1定义和术语下列术语和定义适用于本标准。3.1.1腹泻性贝类毒素diarrhetic shellfish poison , DSP化学结构以大田软海绵酸(okadaic，acid,简称OA)及其衍生物为代表的，摄食后可产生以腹泻为主要特征的存在于贝类体内的海洋生物毒性物质的总称。3.2缩略语3. 2. 1DSP diarrhetic shellfish poinson腹泻性贝类毒素。3.2.2ELISA enzyme linked immunosorbent assay酶联免疫吸附试验。4抽样和制样参照SN0294规定执行。5　测定方法5.1测定原理本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应，游离的腹泻性贝类毒素与腹泻性贝类毒素酶标记物竞争腹泻性贝类毒素抗体，没有被结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质和显色剂加人到孔中并且孵育，结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物，加人反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值，样品中的腹泻性贝类毒素溶液与吸光度值成反比，按绘制的校正曲线定量计算。5.2试剂和材料除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。1 SN/T1996—20075.2.190%甲醇溶液。5. 2.2半对数坐标纸。5. 2. 31DSP标准物质。5. 2. 4酶标记物。5. 2. 5个包被有腹泻性贝类毒素抗体的微孔板5. 2. 6基质（过氧化尿素）/发色剂（四甲基联苯胺）。5. 2. 7)反应终止液：1mol/L硫酸5.2.8商业化试剂盒若测定低限和回收率达到本标准的要求则也适合于本标准。5.3仪器和设备5. 3. 1 酶标仪。5.3.2 均质器。5.3.3离心机：4℃,3000g。5.3.4微量加样器：50uL。5.3.5微量多通道加样器：50μL，100μL5.4试样的提取和净化称取10.0g试样（精确至0.1g），加人5倍90%甲醇溶液，均质1min～2min，3000g离心10min，离心后取上清液，用重蒸馏水按1：2稀释（1+1），取50uL按5.5进行酶联免疫测定。此时的稀释倍数是10。高浓度的样品，如超出标准曲线范围，可进一步用90%甲醇溶液稀释，直至测定值在标准曲线范围以内。5.5酶联免疫测定将足够数量的微孔条插入微孔架（标准液和样液分别做复孔），记录标准液和样液的位置。加人50uL2个～5个腹泻性贝类毒素标准液和样液到各自的微孔，每个标准液和样液应使用新的吸头，加人50μL腹泻性贝类毒素酶标记物至每个微孔，迅速充分混合，22℃～25℃避光处孵育10min。将微孔架倒置在吸水纸上拍打数次，以保证完全除去微孔中的液体，每个微孔注人250μL洗液冲洗后拍干，再重复以上洗板操作4次。加人50μL发色剂至每个微孔中，轻拍混匀，22℃～25℃黑暗避光处孵育6min。加人50μL反应终止液至每个微孔中，迅速混匀后，在10min内以空气为空白调零，测量并记录每个微孔溶液450nm波长的吸光度值。5.6结果的计算和表述5.6.1计算百分比吸光度值计算腹泻性贝类毒素标准液和样液的平均吸光度值，按式（1)分别求得每个腹泻性贝类毒素标准液和空白液的百分比吸光度值：A=号×100%.........(1)So式中：A一一百分比吸光度值；S一一腹泻性贝类毒素标准液或样液的平均吸光度值；S——0 μg/L的腹泻性贝类毒素标准液的平均吸光度值。5.6.2绘制标准曲线以百分比吸光度值（算术