SN_T 4161-2015国境口岸副溶血性弧菌实时荧光PCR方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T境口岸副溶血性弧菌实时荧光PCR 方法Detection method for vibrio parahaemolyticus by real-time fluorescencePCR at frontier ports2015-09-01实施2015-02-09发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局0刮涂层查真优 SN/T 4161—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江西出人境检验检疫局本标准主要起草人：胡婷、杨春华、刘岚、孙思扬、谢玉萍、徐菱菱、周延- SN/T4161—2015国境口岸副溶血性弧菌实时荧光PCR方法1范围本标准规定了国境口岸副溶血性弧菌实时荧光PCR检验的对象、标本的采集、运输和保存，操作方法及结果报告。本标准适用于国境口岸副溶血性弧菌感染的筛选检测。12规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.17—2003食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验GB/T4789.20—2003食品卫生微生物学检验水产食品检验GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193基因检验实验室技术要求WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1副溶血性弧菌vibrioparahaemolyticus副溶血性弧菌，属弧菌科弧菌属，革兰染色阴性，兼性厌氧菌，为多形态杆菌或稍弯曲弧菌。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、发烧、腹泻及水样便（重症者为黏液便或黏血便)为主要症状。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid)PCR：聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)Taq DNA polymerase:Taq DNA聚合酶5检测对象5.1疑似副溶血弧菌感染者的临床标本，如粪便5.2疑似副溶血弧菌污染环境标本，如水样，以及食品。1 SN/T 416120156实验室生物安全和PCR防污染要求实验室生物安全应符合GB19489的规定。PCR防污染措施按WS/T230和SN/T1193的规定执行。7仪器与器材7.1实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管。7.2生物安全柜。7.3高速冷冻离心机：最大转速13000r/min以上。7.4台式离心机（离心速度900g）。7.5涡旋振荡器。7.6恒温水浴锅。7.7高压灭菌锅。7.8低温冰箱、冷藏、冷冻冰箱。7.9可调式微量加样器。8 试剂8.1生理盐水：蒸馏水和NaCl配制浓度为0.9%的生理盐水。8.2阳性对照品：人工制备含副溶血弧菌检测序列的质粒。8.3阴性对照品：灭菌双蒸水ddH2O。8.4DNA提取液：含0.9%NaCl和0.1%EDTA-Na2的混合液。9检测程序9.1样品的采集粪便样本9.1.1采集病人发病早期新鲜粪便于一次性无菌采便管内，成形便采集5 g～8 g,水样便采集1 mL～3mL。亦可用湿润的直肠棉拭插人直肠内3cm～5cm处并轻轻旋转，有可见粪便的棉拭放入采便管内。采便管外表贴上带有唯一标识号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。9.1.2水样标本水样用无菌容器采集3mL～5mL，密闭后外表贴上带有唯一识别标识号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。9.1.3食品标本肉与肉制品的取样方法按GB/T4789.17—2003中的规定。各种水产食品及其制品的取样方法按GB/T4789.20—2003中5.1的规定。9.2样本的运转与保存样本运输采用冰壶加冰密封运输。对于不立即检测的样本，应保存于一20℃待检。2 SN/T4161—20159.3样本的前处理9.3.1粪便样本挑取米粒大小粪便，放置于有0.5mL生理盐水的离心管中，振荡混匀，16200g离心2min。去尽上清，沉淀用于核酸提取。9.3.2水样样本取标本3mL，16200g离心2min。去尽上清，沉淀用于核酸提取。9.3.3食品样本以无菌方法取肉类或水产品组织样品0.1g，用0.2mL无菌生理盐水离心管中研磨，然后100℃沸水中加热5min;8000g离心3min，上清用于以后的荧光PCR反应。9.4样本的DNA提取在标本的前处理沉淀中，加人100μLDNA提取液充分混匀，沸水浴10min。16200g离心5min，上清可直接用于荧光PCR反应。也可以使用商品化的DNA提取试剂盒并按照说明书操作。9.5实时荧光PCR检测9.5.1待检测所需各种试剂充分融化后，请先将各试剂