SNT 2525-2010食品中肉毒梭菌的PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2525-2010食品中肉毒梭菌的PCR检测方法Detection of Clostridium botulinum in foods by PCR2010-03-02 发布2010-09-16实施中华人民共和国7015转查话真发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2525—2010前·言本标准参照美国FDA BAM第17章第 5部分：A、B、E、F型肉毒梭菌 PCR 检测方法［U.S.FDA，Bacteriological Analytical Manual Online,Chapter 17(V),2001 : Specific Detection of Clostridium botulinum Types A,B,E and F Using the Polymerase Chain Reaction(PCR).经研究和验证后制定。本标准的附录 A、附录B均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈双雅、谢明星、张永祥、陈伟玲、王群力、刘棠、彭小莉、周赞虎、张孟璋。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2525—2010食品中肉毒梭菌的PCR检测方法1 范围本标准规定了食品中肉毒梭菌的 PCR检测方法。本标准适用于食品中 A、B、E、F型肉毒梭菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789.12食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验GB/T6682分析试验室用水规格和实验方法GB 19489实验室　生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范　食品分子生物学检测SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。3.1，术语和定义3. 1. 1肉毒梭菌 Clostridium botulinum肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌,厌氧,在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一类具有很强毒性的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。3. 1.2聚合酶链式反应polymerase chain reaction,PCR模板 DNA先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板 DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使退火引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA 片段呈几何倍数扩增。3.2缩略语3.2. 1bp base pair碱基对。3.2.2 deoxyribonucleic acidDNA(脱氧核糖核酸。3.2.3dNTP deoxyribonucleoside triphosphate脱氧核苷三磷酸。 SN/T 2525—20103.2. 4dATP deoxyadenosine triphosphate脱氧腺苷三磷酸。3.2.5dCTPdeoxycytidine triphosphate脱氧胞苷三磷酸。3.2. 6dGTP deoxyguanosine triphosphate脱氧鸟苷三磷酸。3.2.7dTTP deoxythymidine triphosphate脱氧胸苷三磷酸。3.2.8Taq Thermus aquaticu水生栖热菌。3.2.9Tris tris (hydroxymethyl) aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷。3.2. 10EDTAethylene diaminetetraacetic acid乙二胺四乙酸。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全应由具备资格的工作人员检测肉毒梭菌，所有培养物和废弃物应小心处置，并按照GB19489和GB/T27403(中的有关规定执行。5防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行6方法提要样品经增菌后划平板分离单菌落，挑取可疑菌落到TPGY培养，对培养物采用热裂解抽提DNA法，或商品化细菌基因组 DNA提取试剂盒抽提 DNA法制备 PCR模板,进行 PCR 扩增,琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带，从而对食品中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。7设备和材料7.1天平：感量0.001 g。7.2生物安全柜。7.3厌氧培养装置。7.4恒温培养箱：35℃±1℃和28℃±1℃。7.5高压灭菌锅。7.6恒温