SN_T 4747.2-2017进出口食用动物大环内酯类药物残留量的测定 微生物抑制法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4747.2--2017进出口食用动物大环内酯类药物残留量的测定微生物抑制法Determination of macrolide residues in live animal for import andexport--MIA method2017-05-12 发布2017~12-01实施中华人民共和国KD发布国家质量监督检验检疫总局待 SN/T 4747.2—2017前言本部分是SN/T4747系列标准的第2部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草，本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人：王乃福、黄晨、吴冬雪、王万骞、刘洋、董志珍、赵祥平。 SN/T 4747.2--2017进出口食用动物大环内酯类药物残留量的测定微生物抑制法1范围SN/T4747的本部分规定了进出口食用动物大环内酯类兽药残留检测的试样制备和微生物抑制检测方法。本部分适用于出人境检验检疫工作中进出口食用动物血液、尿液中大环内酯类兽药残留筛选检测，阳性结果需用其他方法进行确证。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析试验室用水规格和实验方法3方法提要试样经静置或离心后，取上清液加到含有定数量藤黄微球菌的培养基中，利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试样中是否含有抗生素。4试剂与材料4.1 藤黄微球菌 Micrococcus luteus CMCC 2800l。4.2保存和传代培养基：参见附录A A.1。4.3增菌固体培养基：参见 A.2。4.4检定培养基：参见 A.3。4.5甲醇。4.6磷酸盐缓冲液：称取0.523g磷酸二氢钾（KH2PO）及16.73g磷酸氢二钾（K2HPO4），用蒸馏水溶解并定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。4.7标准物质红霉素：纯度≥98%。4.8红霉素标准储备液：10 μg/mL。称取标准物质红霉素20.0mg（精确至0.1 mg），先用少量甲醇溶解，再用磷酸盐缓冲液定容至 2000 mL，置 2℃～8℃冰箱中保存,可使用7d。4.9红霉素标准工作液：取红霉素标准储备液，用磷酸盐缓冲液稀释成浓度为0.05 μg/ml、0.1 μg/mL、0.2 ug/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL的标准工作液，须当日配制使用。5仪器和设备5.1培养皿：直径90mm，底部平整光滑，具陶瓦盖。5.2离心机：最小离心力不小于4000g。1 SN/T 4747.2---20175.3牛津杯不锈钢,外径8mm±0.1 mm，内径6 mm士0.1 mm,高度10mm士±0.1 mm。5.41恒温培养箱：0℃～50℃，搁板应保持水平。5.5游标卡尺：测量范围为0mm～200mm,精度0.02mm；可采用抑菌圈测量仪或其他等效测量仪器。5.6电子天平：感量0.0001g。5.7高压灭菌器。5.8可调移液器:1 μL～10 μL,20 μL～100 μL,100 μL～1000 μL。5.9其他：试管、离心管、克氏瓶等。6分析步骤6.1试样制备6.1.1血液：未加人抗凝剂的全血样品于室温（20℃～22℃)静置2h～4 h（防止暴晒），取析出的血清进行检测；如无血清析出，将样液3000g离心15min后，取上清液进行检测。6.1.2尿样：样液经3000g离心15min后，取上清液进行检测。6.2菌悬液的制备将复活的菌种（参见附录B)接种于盛有增菌用固体培养基的克氏瓶中，反复倾斜克氏瓶，使菌液均匀覆盖在培养基表面，30℃培养18h士1h后，用10mL灭菌生理盐水洗下菌苔，制成菌悬液,2℃～8℃冰箱中保存，贮存期15d。6.3菌悬液用量的测定在实际测定前,将菌悬液进行10倍梯度稀释并分别加人到检定培养基中，制成平板，能使 0.05 μg/mL红霉素标准工作液产生大于或等于10 mm清晰、完整的抑菌圈为最佳菌悬液用量。6.4菌悬液用量的测定检定用平板的制备：将检定培养基熔化后，冷却至45℃～~50℃，加人适量菌悬液，混匀，立即取15mL，注人培养皿中，使培养基均匀覆盖在其底面，保持水平使其凝固。制备好的平板置2℃～8℃冰箱中保存,贮存期 2 d～3 d。6.5标准曲线的制备红霉素标准工作液(4.3.5)0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL五个浓度中,0.2 μg/mL标准工作液作为参考浓度。每个红霉素标准工作液浓度除参考浓度(0.2 μg/mL)外，各取三个检定用平板为一组，四组共12个检定用平板。