SN 1586.1-2005菜豆细菌性萎蔫病菌检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1586. 1—-2005菜豆细菌性菱蕉病菌检测方法Detection for Curtobacteriumflaccumfaciens py. flaccumfaciens (Hedges)Collins and Joues2005-05-20 发布2005-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1586. 1--2005言前本标准的附录 A、附录 B、附录 C为资料性附录,本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：种焱、洪炜、宁跃明、赵纪文、赵汗青。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 1586. 1—2005菜豆细菌性萎蒸病菌检测方法1 范围本标准规定了进境植物检疫中菜豆细菌性萎病菌检测方法。本标准适用于来自菜豆细菌性菱病发生国家和地区的菜豆、绿豆、豇豆、大豆和丁癸草等植物种子的进境检疫。2 仪器和试剂2.1仪器设备生物显微镜、荧光显微镜、超净工作台、生物培养箱、天平、高速冷冻离心机、高压灭菌器、烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养皿、载玻片、盖玻片、酒精灯等。2.2实验用具手术刀、手术剪刀、镊子等。2.3 培养基配方2.3.1营养葡萄糖琼脂培养基(NDA)营养琼脂+1%（质量浓度)葡萄糖。2.3.2金氏 B培养基20 g蛋白陈,10 g甘油，1.5g磷酸氢二钾(KzHPO），1.5 g硫酸镁(MgSO·7H²0),15g琼脂，1 000 mL蒸馏水。pH=7.2。2. 4浸泡液配方(Lelliott 和 Setar)20 g抗泡沫剂复合物,2g焦磷酸钠盐，1g Lubrol W Flakes表面活性剂,1000 mL蒸馏水。3现场检疫和抽样对一批来自菜豆细菌性菱焉病发生国家和地区（参见附录 A、附录B)的菜豆、绿豆、豇豆、大豆和丁癸草等植物种子按进境总量的0.5%～5%的比例随机扦取样品。现场检疫和抽样时应重点观察种子表皮的颜色，尤其是种皮下和种脐部位是否带有黄色的细菌粘胶层或细菌粘液。4方法和步骤4.1 外观症状4.1.1种子的颜色菜豆细菌性菱病菌存在于大豆和菜豆的种子内外部。系统侵染的种子在种皮下有一层厚的细菌层，呈亮黄色，表面侵染的种子仅在种脐有一点黄色细菌粘液。若是受其他变种侵染，则呈桔黄色或紫色。一旦发现异常种子需进行隔离种植或间接分离病菌。4.1.2植株症状观察待种植于隔离温室或指定隔离场地的种子长出幼苗后，对其表现进行系统的观察，主要观察出苗情况、植株和叶片有无异常表现及豆荚上有无异常等。一旦发现异常植株需直接进行分离病菌。1 SN/T 1586. 1—20054.2病菌的分离、测定4.2.1直接分离切取病株变色维管束,部分浸于无菌水中镜检。若有大量细菌存在，准备 NDA(营养葡萄糖琼脂)培养基和金氏B培养基分离。24℃～27℃下培养 3d～4 d后，观察是否有生长相当慢、扁平、流质状的黄色菌落，同时进行萃兰氏染色，若阳性，表明可能有此菌存在，若金氏B培养基上有绿色荧光菌落，表明可能是菜豆晕疫病菌（Pseudomonas phaseolicola）侵染，而非菜豆细菌性萎蕉病菌侵染，需对病原菌作进一步鉴定和确诊。4.2.2间接分离将4份（每份30g)种子样品在100mL蒸馏水中浸泡14h，加人100mL浸泡液，在5℃状态下3000r/min匀浆10min，然后在180×g、4℃下离心10min，上清液纱布过滤后再在4℃6000×g下离心10 min,沉淀悬浮于 3mL灭菌蒸馏水中。此悬浮液可用于划线分离或稀释分离，以及用于致病性测定和生理生化测试。4.2.3致病性测定致病性测定可选用感病品种（如Nano Borlottl di Vigevano)菜豆苗，温室条件下培育至二叶期，在子叶和初生叶间的茎上纵切一2cm的伤口，涂抹菌液或样品制备液（见4.2.2），菌液浓度为10°cfu/mL～10°cfu/mL，然后用凡士林封伤口，接种苗在16℃～18℃下生长20d，观察症状，再用4. 2.1法分离病原菌。4. 2. 4生理生化测试将分离到的病菌接种在相应的培养基上对其耐盐性，与温度的关系，好氧性和厌氧性，碳素化合物的利用和分解，氮素化合物的利用和分解及大分子化合物的分解能力进行测试。5鉴定依据5.1 症状菜豆萎焉病菌通过带病种子或越冬病残体侵染种苗，通常可导致幼苗死亡，若种苗存活，则无叶片生长。菜豆最典型的症状是种苗叶片逐渐萎，伴随褪色，植株矮化。幼枝枯死。褪色叶片通常具深绿色、褐色或红褐色病斑，变色区首先软化，随后于枯，叶片水渍状接种点产生白泡。有时缺乏上述症状，叶片表现为金黄色坏死斑或叶片仅部分萎菱蕉，与菜豆普通疫病（Xanthomonascamp