免疫细胞及其功能检验技术（免疫学检验课件）.pptx

第二十二章免疫细胞及其功能检验技术 免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，主要包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞、各种粒细胞、红细胞和肥大细胞等。 临床上如出现感染、自身免疫病、免疫缺陷症、肿瘤等疾病以及移植后的免疫抑制状态时，均可出现不同免疫细胞或其亚群的数量和功能的变化。※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定※方法：体外法为主※目的：判断机体免疫状态※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效 根据各类免疫细胞独特的表面标志及其特殊功能，运用一定方法将其从血液或组织中分离出来，对其进行数量和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段,也是细胞生物学、免疫学中进行细胞分离、培养和建立细胞株等研究的重要基本技术之一。 目　录 免疫细胞的分离与纯化1淋巴细胞数量及功能检测2吞噬细胞功能检测3 第一节 免疫细胞的分离与纯化 免疫细胞的分离方法很多，主要根据细胞表面标志、理化性状和细胞功能等特征。应根据实验目的、所分离的目的细胞群种类、数量和纯度等要求选择分离方法。所用的方法应力求操作简便、尽量保持细胞活性兼顾细胞纯度和获得率。 1外周血单个核细胞的分离2淋巴细胞的纯化及其亚群的分离3白细胞的分离吞噬细胞的分离4 （一）自然沉降法是利用血细胞自然沉降率的分离方法。采集外周静脉血，肝素抗凝，将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，由于红细胞沉降速率较快，可使白细胞与之分离。上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞。吸取富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 一、白细胞的分离 （一）自然沉降法 加抗凝血于试管中室温或37℃中静置（30-60min）分层结果示意图 某些高分子聚合物如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等可使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。 RBC血浆(抗凝血)WBCRBC 此法白细胞获得率比自然沉降法高，但其中的明胶法可使白细胞粘性增加，对实验产生一定影响。（二）高分子聚合物沉降法 （二）高分子聚合物沉降法抗凝血与等量3%明胶或6%右旋糖酐溶液混匀室温或37℃中静置（30～60min）分层结果与自然沉降法类似优点：速度快、得率高不足：白细胞黏性增加 外周血单个核细胞(PBMC)主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离常用分层液：ficoll－hypaque（聚蔗糖-泛影葡胺），percoll二、外周血单个核细胞的分离 人外周血中各类血细胞密度常用的分离液：Ficoll液和Percoll液尤以密度为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分层液（Ficoll液）最常用。细胞比重血小板1.030~1.035PBMC1.075~1.090多核白细胞1.092红细胞1.093 用1.077±0.001的分层液可将细胞分离 　 Ficoll分离液法：密度1.077±0.001，主要用于分离外周血中的单个核细胞。 原理：Ficoll分层液： 2份6%聚蔗糖（ficoll)水溶液 + 1份34%泛影葡胺（hypaque)生理盐水溶液。离心：密度梯度离心分离：各类细胞按其相应密度重新分布。 分离纯度可达95%，细胞获取率80% 。试验尽量在低温下进行（4 ℃ ~8 ℃或冰浴）。　　（一）Ficoll分离法 注意：温度以20℃最适宜，超过25℃影响细胞得率 Ficoll分层液分离单个核细胞示意图 （二） Percoll分层液法连续密度梯度分离液（Percoll液+PBS，离心）加入PBMC悬液或抗凝全血1000×g离心20min结果示意图 78％98％（二）Percoll分离单个核细胞 三、淋巴细胞的纯化及亚群的分离采用Ficoll和Percoll分离法获得的细胞悬液成分仍然较为复杂、均一性不佳。通常需要进一步分离纯化淋巴细胞及其亚群。分离原理主要基于细胞的表面标志和功能等性质。淋巴细胞及其亚类的分离纯化是免疫学检验与研究的重要基础技术。 ﹡红细胞的去除：一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。﹡血小板的去除 ：将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。 在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板 。一、淋巴细胞的纯化 PBMC悬液主要含淋巴细胞，但一般还混杂有数量不等的单核细胞及少量粒细胞、红细胞和血小板。 ﹡单核细胞的去除：黏附法