酶免疫技术—酶联免疫吸附试验（免疫学检验课件）.pptx

酶联免疫吸附试验;酶联免疫吸附试验（ELISA）;二、ELISA的方法类型（六种）;;（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。 ;; 双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF)的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶标抗体可消除RF的干扰。 ;（二）双位点一步法检测抗原;; ; 如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成“钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。;（三）间接法检测抗体; ;（1）将特异性抗原包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加稀释的受检血清，洗涤。 （3）加酶标二抗，洗涤。 （4）加底物显色，颜色深度代表标本中待检抗体 的量。 ; ; 由于此法易受血清中高浓度非特异性IgG的干扰，通常要将待测标本进行一定稀释后才能测定。;（四）竞争法;酶标抗原;（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。 （3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。; ; 抗体的测定一般不使用竞争法。当抗原杂质难以去除，不易得到足够的纯化抗原或抗原的性质不稳定时，可采用这种方法测定抗体。如HBcAb和HBeAb的检测，由于e抗原较核心抗原仅多29个氨基酸，e抗原很容易转变为核心抗原，因此HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但模式有所不同。;（1）竞争法检测HBcAb： ①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。 ②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。 ③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。;;3.加酶作用的底物 显色;（2）竞争法检测HBeAb： ①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。 ②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。 ③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。 ④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。;;;（五）捕获法检测IgM抗体;（1）将抗人IgMμ链抗体包被于固相反应板上， 洗涤。 （2）加人待检标本，温育，洗涤。 （3）加入特异性抗原，温育，洗涤。 （4）加入抗原特异的酶标抗体，温育，洗涤。 （5）加入底物，温育一定时间，显色，用酶标 比色仪测定结果。;;5.加酶作用的底物 不显色; 采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF（IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导致假阳性反应。 ; 非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。 ;（六） 双抗原夹心法检测抗体;;4.加酶作用的底物 不显色;ELISA的技术要点包括三个方面：反应所需各种试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。;酶标记的抗原和抗体 固相的抗原或抗体 标记酶作用的底物;（二）最适工作浓度的选择;（1）用包被液将抗原作一系列稀释后包被，洗涤。 （2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，温育，洗涤。 （3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，温育，洗涤。; （4）加底物显色，加酸终止反应后读取A值。 （5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右，阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀释度作为工作浓度。 ;;1．加样 应力求准确，并注意不可溅出和产生气泡。 2．温育 注意反应的温度和时间应按规定的要求，整块反应板的温度应一致，以防止“边缘效应” 。 3．洗涤 手工洗板是在每次温育后，将反应液吸出或甩干，然后用缓冲液洗涤2或3次，拍干。使用洗板机洗涤次数要适当增加。; 4．显色 根据试剂盒说明操作即可。 5．比色 要注意波长的选择。操作中应注意避免出现滤光片错用的问题。 ;四、评价与应用; 3．肿瘤标志物 AFP、CEA等 4．蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、各种血浆蛋白质、同工酶等。 5.药物和毒品测定 如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。 ;小 结