SN_T 3277-2012鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3277—2012鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法Detection and identification of avocado sunblotch viroid2013-05-01实施2012-10-23 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T言本标准按照GB/T 1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：郑耘、陈枝楠、张永江、卢小雨、冯建军、汪莹、李一农、刘新娇。1 SN/T 3277—2012鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了进境植物检疫中对鳄梨日斑类病毒的RT-PCR、往返聚丙烯酰胺凝胶电泳和生物学测定三种检疫鉴定方法。本标准适用于进出境鳄梨种苗中鳄梨日斑类病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样规则3原理鳄梨日斑类病毒（avocado sunbjotch viroid，ASBVd)属于鳄梨日斑类病毒科（Avsunviroidae)鳄梨日斑类病毒属（Ausunviroid)。该类病毒的分子生物学和生物学特性(参见附录 A)是检疫鉴定的主要依据。4仪器设备及设施、用具及试剂4.1仪器设备及设施天平（感量，1/10000g）、pH计、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离检疫温室、恒温水浴、低温冰箱等。微量移液器(2 μL,10 μL,20 μ,100μL,200 μL,i000 L）、研钵/离心管、花盆、消毒土等。4.2RT-PCR 检测试剂见附录 B。4.3往返聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试剂见附录 C。5样品制备抽样按照SN/T2122的规定执行。5.1种子类随机抽取100粒种子,将其分为五组,在适宜的发芽温度(20℃～28℃)条件下催芽，直至长出第一对真叶。随机抽取20株苗叶片，每株取1g叶片，制备成-个样品。1 SN/T 3277—20125.2　苗木类将鳄梨苗木等繁殖材料种植在隔离温室中，于 25℃生长并观察症状。取 1g表现症状和无症状植株的叶片（或花芽），制备成一个样品。6检测方法6.1＇RT-PCR 检测方法见附录 B。6.2往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定方法见附录 C。6.3生物学测定方法见附录 D。7 结果判定如 RT-PCR检测结果为阳性,往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,或生物学测定也为阳性，可判定待检样品带有鳄梨日斑类病毒。如RT-PCR检测结果为阴性，往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，或生物学测定结果也为阴性，则可判定待检样品不带有鳄梨日斑类病毒。如 RT-PCR检测结果、生物学测定结果，或往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定中，任意一个为阳性，而其余为为阴性，则需重做实验。8样品和档案保存8.1样品保存经检测确定携带鳄梨日斑类病毒的样品干燥后在一80℃冰箱保存1年。在鳄梨繁殖材料中发现该类病毒的，采集叶片、花芽等类病毒浓度较高的材料干燥处理保存。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档，以便必要时复核。8.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、登记时间、实验地点、检测方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。RT-PCR检测应有电泳结果和往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定需有图片，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。2 SN/T 3277-2012附录A(资料性附录）鳄梨日斑类病毒生物学特性A.1 病原及其特性ASBVd为棒状结构，是一条共价闭合的单链环状RNA分子，由长度为 247个核苷酸残基组成，相对分子质量为0.8X105 da。ASBVd序列独特，富含 A-U碱基，与其他类病毒的同源率低，具有自我切割的特性。ASBVd在寄主的叶绿体内增殖和积累，滴度很高，有时与寄主5S RNA的浓度相当。A.2 寄主范围寄主范围仅限于樟科鳄梨属植物，表明其与寄主植物具有高度的特异性。A. 3 病害症状受ASBVd侵染的鳄梨（Perseaamericana Mill.），树势衰弱，在果实上出现黄色、白色或粉红色的斑纹，有时水果上能形成下陷的火山口状病斑，病斑可为黄色、绿色和深红色，受害果实市场价值降低；还可以在茎、子叶上引起黄色、橙色或白色的下陷的斑或点；在叶片上引起褪绿和扭曲。受害植株比健康植株稍矮，但较难区分。田间 ASBVd的典型症状是枝权表皮上的条纹和斑点。ASBVd侵染鳄梨后，造成严重的经济损失。病果树与健康果树相比，产果数量减少，产量下降30%以上，树干矮