SN_T 2709-2010国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2709—2010国境口岸产气英膜梭菌毒素检测方法Detection of Clostridium perfringens toxins at frontier port2010-11-01发布2011-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2709—2010前 言本标准按照GB/T1.1一2009 给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：相大鹏、师永霞、林继灿、李小波、陈永红、洪烨、黄吉城、郑夔、幸芦琴、郭波旋、钟玉清。I SN/T 2709--2010国境口岸产气英膜梭菌毒素检测方法1范围本标准规定了产气荚膜梭菌食物中毒样品的采集和运送、产气荚膜梭菌的分离培养、产气英膜梭菌肠毒素的检测、产气荚膜梭菌 α、β和肠毒素基因的 PCR检测及多重 PCR检测以及生物安全要求。本标准适用于国境口岸入出境人员以及国境口岸食品生产经营和服务单位从业人员的产气英膜梭菌食物中毒，同时也适用于国境中岸范围的水、食物、食物中毒样品的产气荚膜梭菌毒素检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注白期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.13食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验GB/T 4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂SN0177出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法WS/T 7产气荚膜梭菌食物中毒诊断标准及处理原则3术语和定义下列术语和定义适用于本仗件。3. 1产气英膜梭菌Clostridium perfringens是一种革兰氏阳性、产生芽孢、严格厌氧及形成特殊荚膜的梭状杆菌。广泛分布于自然界的水源、土壤中及存在于人和动物肠道中，可以引起人和动物坏死性肠炎、肠毒血症以及人畜创伤性气性坏疽，特别是引起严重的食物中毒。3.2产气英膜梭菌毒素Clostridium perfringens toxins产气荚膜梭菌主要产生 α、β、ε、外毒素和肠毒素 CPE。根据该菌产生致死性 α、β、ε、外毒素的能力不同,可以分为 A～E共5种菌型,其中对人致病的主要是 A型(产生α毒素,部分菌株还产生肠毒素CPE)，也有少数为C型(产生α毒素和β毒素），主要引起人的食物中毒和坏死性肠炎，甚至可以引起肠毒血症,造成人的死亡。4试剂和材料4.1主要仪器4.1.1PCR扩增仪。 天平。.3超净工作台。 SN/T 2709—20104. 1.4高压灭菌锅。4.1.5低温高速离心机：最大离心力20000g。4.1.6E电泳仪。4.1.7凝胶成像分析系统。4.1.8旋涡振荡器。4.1.9冰箱:4℃和20℃。4. 1. 10移液器:10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和1 mL。4.1.11恒温水浴锅。4. 1. 12恒温培养箱：37℃±2℃。4. 1. 13厌氧培养装置。4.2主要试剂4.2.1除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。4.2.2Taq DNA 聚合酶。4.2.3　产气荚膜梭菌肠毒素 ELISA检测试剂盒（美国 TECHLAB公司)²)。4.2.4其他试剂参见附录 A。5生物安全要求5.1样品的病原菌分离纯化、生化鉴定、涂片、显微观察、免疫学实验、PCR扩增模板制备等含有致病性活菌的初步检测活动需在生物安全二级实验室(BSL-2)进行。5.2家兔肠祥试验需在动物生物安全二级实验室（ABSL-2)进行。5.3不含致病性活菌材料的PCR操作和免疫学等实验需在生物安全一级实验室(BSL-1)进行。6样品的采集和运送6.1样品的采集6.1.1患者粪便标本的采集用灭菌竹签或吸管等工具采取腹泻患者粪便2mL，置于灭菌试管或盛有生理盐水的试管中。采不到粪便的人员可用肛拭采取。6.1.2可疑食物标本的采集一般采用灭菌食品夹子或铲子等工具采取剩余食物，采取的标本可置于灭菌容器中。固体食物200g～500g;液体食物200mL～500mL。饮料、饮用水等液体样品，定性包装的可整体采取，散装的可置于罐(瓶)中。6.1.3食品加工用具、容器表面涂抹物等标本的采集饮食用锅、刀、抹布、砧板、盛放器具等加工用具可用粘取少量灭菌生理盐水的灭菌棉拭涂抹容器内壁,其他用具可涂抹与食品接触的表面，涂抹完毕将棉拭置于装有生理盐水的试管中。1）、2）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2 SN/T 2709—20106.2样品的运送采集的样品应在冷藏条件下，4