超声波协同流水净化对活体克氏原螯虾携带菌量及菌相构成的影响.docx

超声波协同流水净化对活体克氏原螯虾携带菌量及菌相构成的影响 元浩虾通常被称为小龙虾，具有清新、美丽、独特的口感。它是一种高品质的低脂肪和蛋白食品，深受消费者欢迎。克氏原螯虾原产于北美洲,是我国目前养殖范围最广的淡水螯虾种类。近年来,江浙沪地区大中城市的年小龙虾消费量都在万吨以上,仅江苏地区小龙虾产品(虾仁和整肢龙虾)出口量达5 500 t 1 材料和方法 1.1 动物、试剂和生工生物 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)样品来源于扬州本地的生态农业有限公司,平均质量为(39.5±1.5) g/只。 营养肉汤琼脂培养基和LB培养基广州环凯生物试剂有限公司;蛋白酶K、10×Buffer、d NTPs、 Ta q酶 、 D N A M a r k e r 、 细菌1 6 S r D N A扩增引物 (8F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和15R: 5’-AAGGAG GTGATCCAGCCGCA-3’)、随机引物 (AP31:5’-AGGGGTCTTG-3’)生工生物工程(上海)股份有限公司;其他化学试剂均为国产分析纯。 1.2 仪器、仪器与仪器 B S 2 1 0 S型电子天平北京赛多利斯天平有限公司;KQ5200超声波洗涤器昆山市超声仪器有限公司;FSH-2型可调高速匀浆机金坛市荣华仪器制造公司;UV-2401PC紫外分光光度计日本岛津公司; TG16-WS型台式高速离心机湘仪离心机仪器有限公司;SX-500型高压蒸汽灭菌锅日本Tommy公司; DGX-9053B-2型生化培养箱上海福玛实验有限公司; ABI2720热循环仪美国Life Technologies公司;DYYSB型稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂;凝胶成像系统法国Vilber Lourmat公司。 1.3 方法 1.3.1 样品采集 从捕捞不超过2 h的克氏原螯虾中,挑选色泽均一、 体格健硕、活力强的个体,加冰块保藏并运送到实验室后立即实验。 1.3.2 超声净化处理 随机选取10只克氏原螯虾测定起始带菌量,其余虾随机分成3组,每组30只放入3只容量10 L的超声波洗涤器(40 k Hz,160 W),将净水器过滤的自来水接入洗涤池,调节水流量为45 L/h,净化时间为12 h。处理组1不加超声波处理;处理组2在2 h超声处理1次,持续时间120 s;处理组3在2、6 h超声处理2次,持续时间均为120 s,净化过程中每隔4 h取样1次,每次10只用于菌落总数测定。 1.3.3 菌落盐水的制备 将克氏原螯虾头尾分开,无菌条件下分别取腮部, 肠道以及尾部的壳与肉部分,将取下的三部分样品分别称质量后参考文献[13]的方法与灭菌生理盐水按1∶10(m/V)的比例混合并匀浆,无菌吸取匀浆1 m L用灭菌生理盐水做10倍递增稀释。选择5个连续稀释度,每个稀释度取250 μL涂布营养肉汤琼脂培养基,每个稀释度涂布2个培养皿,倒置于37 ℃培养箱培养36 h,人工计数并计算菌落总数(CFU/g),实验重复3次,取平均值表示样品中的菌落总数。 1.3.4 培养条件确定 每个样品 选择3个分离良 好 ( 菌落数在100~300 CFU/g之间,菌落无黏连)的菌落计数平板挑取单菌落,每个平板随机挑取总菌落数的10%~15%,挑取的单菌落在营养肉汤琼脂平板上划线纯化,挑取单菌落接种于LB液体培养基,37 ℃条件下培养24 h,培养物进行标号后加15%甘油于-70 ℃条件下冻存备用。 1.3.5 烷基三甲基溴化铵 细菌基因组DNA的提取方法参照文献[14]所述的十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethy ammonium bromide,CTAB)法提取。 1.3.6 rapd扩增 菌株之间 的基因型 差异通过R A P D指纹图谱 鉴别。以细菌基因组DNA为模板,应用AP31随机引物进行RAPD扩增。将DNA提取物用dd H 1.3.7 聚类分析聚类分析 根据在指纹图谱中同一迁移率位点上的扩增条带的 “有”和“无”进行数字化处理,用“1”表示“有”, “0”表示“无”,建立矩阵,应用DPS7.05数据处理系统中的0-1系统聚类分析程序,选择Nei氏遗传距离和类平均法进行聚类分析。 1.3.8 dntps1. 以基因组DNA为模板进行16S r DNA的PCR扩增。 PCR反应体系(50 μL)包括:模板(50 ng/μL) 2.0 μL、 d N T P s ( 1 0 m m o l / L ) 2 . 0 μ L 、 2 5 p m o l / μ L引物8 F和15R各2.0 μL、10×Buffer 5.0 μL、Mg Cl 2 结果与分析 2.1 虾壳和肠腺菌落总数的比较 由图1A可知,虾壳+肉中的菌落总数为6.64(lg