QB_T 4363-2012牙膏中蛋黄球蛋白（IgY）活性效价测定方法.pdf

ICS 71.100.40分类号：Y43层备案号：37981-2013中华人民共和国轻工行业标准QB/T 4363-2012牙膏中蛋黄球蛋白（IgY）活性效价测定方法Determination of immunoglobulin egg yolk in toothpastes2012-11-07 发布2013-03-01实施发布中华人民共和国工业和信息化部 QB/T言本标准按GB/T1.1一2009进行编写。本标准由中国轻工业联合会提出。本标准由全国牙膏蜡制品标准化中心归口。本标准起草单位：上海美加净日化有限公司。本标准主要起草人：陈健芬、张琰、孙东方、李显波、孙晓青。I QB/T 4363—2012引言1971年瑞典学者Engvail和Perlmann、荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）。ELISA法已被国际组织ASTM(American Society for Testing and Metierial)公认是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，已被广泛应用在免疫学检验的各领域中。它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。本方法测定的对象是用变形链球菌ATCC25175和亲缘链球菌ATCC0715免疫产蛋母鸡，从其鸡蛋黄中提取的抗龋齿IgY抗体在牙膏中的活性效价。I QB/T 4363—2012牙膏中蛋黄球蛋白（IgY）活性效价测定方法1范围本标准规定了牙膏中蛋黄球蛋白（IgY）活性效价的检测方法。本标准适用于牙膏中添加蛋黄球蛋白（IgY）活性效价的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 601化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(NEQISO6353-1:1982)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(NEQISO3696:1987)3试验方法本标准所用试剂和水，除特殊规定外，均为分析纯试剂和符合GB/T6682规定的水。本标准中分析用标准滴定溶液、试验方法中所用制剂和制品，除特殊规定外，均按GB/T601和GB/T603的规定制备。3.1原理利用抗原-抗体特异性免疫反应的原理，将抗原包被于酶标板上，加入特异性IgY抗体反应，再加标有辣根过氧化酶的抗IgY的第二抗体，最终加入酶的底物，使酶催化底物显色，结果为阳性且稀释比最大的为最终效价比。3.2仪器和设备a）96孔酶标板;b)移液枪2 把，量程分别为：10μL～100μL、100μL～1000 μL;c)微量进样器：精确度0.50μL，量程0μL～25μL;d)分析天平：精确至0.001g;e)电热恒温箱：精度土1℃;f)冰箱：精度±1℃;g）酶标仪：型号Multiskan MK3或相当仪器。3.3生化试剂a）抗原：将菌浓度为2×10cfu/mL的变形链球菌ATCC25175和亲缘链球菌ATCC0715灭活制得；b）酶标第二抗体：兔抗鸡IgG辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗。3.4试剂配制3.4.1包被缓冲液：准确称取Na2CO31.59g、NaHCO32.93g，加双蒸馏水定容至1000mL，得到0.05mol/L的碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，4℃保存，有效期14天。3.4.2稀释抗原：用包被缓冲液稀释抗原至合适浓度。变形链球菌ATCC25175和亲缘链球菌ATCC0715的抗原用包被缓冲液稀释（即1份抗原加4份包被缓冲液）。3.4.3洗涤液（PBST）：准确称取NaCl 20.20 g、KH2PO40.20 g、Na2HPO4:12H2O 2.83 g，加Tween-205.0mL，加双蒸馏水定容至1000mL，4℃保存，有效期3个月。3.4.4稀释液（PBS)：准确称取 NaC18.0 g、KH2PO4 0.20 g、Na2HPO4·12H2O 2.90 g、KCl0.20 g，加双蒸馏水定容至1000mL，4℃保存，有效期3个月。1 QB/T 4363-20123.4.5封闭液：1%牛血清白蛋白（0.1g牛血清白蛋白加10 mlPBS）。3.4.6酶标第二抗体的稀释：用PBS将酶标第二抗体按1:6000的浓度稀释，每次使用应做到现用现稀释。mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：准确称取C6HgO7·H207.30g、Na2HPO4·12H202