SN_T 4399-2015国境口岸伯氏疏螺旋体实时荧光PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4399—2015国境口岸伯氏疏螺旋体实时荧光PCR检测方法Detection with real-time PCR for Borrelia burgdorferi at frontier port2015-12-04 发布2016-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局涂层 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准国境口岸伯氏疏螺旋体实时荧光PCR检测方法SN/T4399-2015*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045)总编室：（010址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.5字数9千字2016年7月第一版2016年7月第一次印刷印数1—1100*书号：155066·2-30380定价14.00元 SN/T 4399—2015前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研究所。本标准主要起草人：瀚文东、杨德文、王艳梅、孙毅、程成、徐宁、付维明、丁淑丽、包力。I SN/T4399—2015国境口岸伯氏疏螺旋体实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸伯氏疏螺旋体(三种常见基因型B.garinii,B.b.s.s和B.afzeli)的检验对象、方法、生物安全要求及结果判定。本标准适用于国境口岸伯氏疏螺旋体（三种常见基因型B.garinii,B.b.s.s和B.afzeli)的实时荧光PCR的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1312国境口岸森林脑炎监测规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1伯氏疏螺旋体borreliaburgdorferi细胞外寄生、微嗜氧型的螺旋体，经蜱传播，是引起人体莱姆病（Lyme disease)的病原体，引起的临床症状多样，除慢性游走性红斑和关节炎外，还常伴有心脏损害和神经系统受累等症状。4检测对象4.1疑似感染伯氏疏螺旋体的临床样本如血液及其他组织样本。4.2从出入境交通工具、集装箱及口岸地区等场所采集的游离蜱及从上述场所宿主动物体表采集的寄生蜱。4.3出人境交通工具、集装箱及口岸地区等场所的宿主动物。5生物安全和分子生物学检测防污染要求5.1检测工作中的个人防护按照GB19489的规定执行。5.2实验室应遵循GB19489对生物安全2级实验室（BSL-2)的生物安全要求。5.3使用过的实验用品应按照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。6仪器和试剂6.1仪器和器材本方法使用主要仪器和设备如下：1 SN/T 4399—2015实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管；生物安全柜；高速台式离心机（最高离心力12000g以上）；台式离心机（最高离心力2000g以上）；漩涡振荡器；恒温水浴锅；高压灭菌锅；低温冷藏、冷冻冰箱；微量可调移液器（10μL，100μL，200μL，1000μL）及配套带滤芯吸头；Eppendoff管。6.2主要试剂除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格溶菌酶（20g/L）、蛋白酶K（10g/L）、RNA酶（10g/L）、150μL酚、三氯甲烷、异戊醇混匀液。-PCR反应液：ABI公司的PCRMIX!，品名为TaqmanUniversalMasterMixIⅡ，withUNG1-pack.荧光PCR引物、探针：应为色谱纯。阳性菌株或质粒：与相应PCR引物、探针匹配。用于荧光PCR检测的伯氏疏螺旋体通用引物和探针序列如下：Reverse primer 5-AGC CTT AAT AGC ATG C/TAA GCAAAA TG-3Forward primer 5-CTA GTG TTT TGC CAT CTT CTT TGA AAA-3Probe FAM 5-GCG CTG TTT TTT TCA TCA AGG CTG CTA AC-3-TAMRA7检测程序7.1样本的采集7.1.1血液样本无菌方法采集血液，EDTA抗凝后无菌试管4℃保存，立即送检。7.1.2人体组织样本人体组织样本，如典型红斑或溃疡斑组织切片、关节液、脑脊液等可作为病原学检测样本，无菌保存后立即送检。7.1.3蜱及宿主动物样本蜱及宿主动物采集后首先进行分类鉴定，按照SN/T1312进行。7.2样本的运送与