SN_T 2733-2010小反刍兽疫检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2733—-2010小反鱼兽疫检疫技术规范Quarantine protocal for peste des petits ruminants2010-11-01 发布2011-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数葬院 SN/T 2733—2010前言本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国西藏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：董俊、杨建民、严树发、杨云庆、艾军、叶玲玲、徐自忠、花群义、周晓黎。 SN/T 2733—2010小反刍兽疫检疫技术规范范围1本标准规定了小反刍兽疫的病原分离及鉴定、聚合酶链式反应、血清抗体中和试验、酶联免疫吸附试验检测方法。本标准适用于小反台兽疫的诊断和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出入境动物检疫采样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 peste des petits ruminants; PPR小反刍兽疫由小反兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。4 疾病简介参见附录 A。5现场检验检疫及采样5.13现场检验检疫：逐头进行临床检查，根据临床表现和特异性病理变化做出初步诊断。5.2采样：按GB/T18088规定，逐头进行采样，并按规定填写《送样单》送实验室。6 诊断方法6.1病毒分离、鉴定（生物安全三级实验室进行)6.1.1试剂和材料小反台兽疫标准阳性、阴性血清。细胞：羊肾原代细胞或非洲绿猴肾细胞(VERO)。培养液:199 或 MEM 培养基中加10%犊牛血清（经 56℃ 30 min 灭能），含青霉素200 IU/mL、链霉素 200 IU/mL。1 SN/T 2733—20维持液：199或 MEM培养基中加2%的犊牛血清（经 56℃ 30 min 灭能），含青霉素200 IU/mL、链霉素 200 IU/mL。细胞分散液：配制见附录B。犊牛血清：不含细菌、支原体,56℃灭能30 min。 PBS缓冲液:配制见附录 B。6.1.2i设备6. 1.2. 1超净工作台。6. 1.2.2乳钵或组织捣碎器。6. 1.2.3倒置显微镜。二氧化碳培养箱。可调单头微量移液器(0.5 μL～10 μL,10 μL～100 μL,100 μL～l000 μL)。冷冻微量离心机。24孔、96孔细胞培养板。6. 1.2.8 微型振荡器。6.1.3样品采集活体动物采集眼脸下结膜分泌物和鼻腔分泌物、颊部及直肠粘膜病料拭子。采集全血时加肝素抗凝剂。死亡动物，解剖尸体2头～3头，取淋巴结，特别是肠系膜和支气管淋巴结，脾和肠粘膜也应采集。采集后立即密封、冷藏送检或置含抗生素的PBS缓冲液中一20℃密封保存。编号和作好记录。眼脸下结膜分泌物和鼻腔、部及直肠粘膜病料拭子：用拭子采取分泌物，拭子一并放人盛有1.0mL含抗生素的PBS缓冲液的1.5mL离心管中。编号，冷藏送检或低温密封保存。血液：无菌、肝素抗凝采集,密封、编号后保存于4℃送检。组织脏器：无菌采集待检样品，装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，密封、冷藏送检或低温密封保存。精液：抽检的精液样品应不少于1mL，冻精样品每头每批次取样3管～5管，编号，置冰盒送检。6.1.4　样品贮运样品采集后，按批次放人密闭的采样袋内，低温、密封，送实验室。6.1.5样品处理眼脸下结膜分泌物和鼻腔分泌物、颊部及直肠粘膜病料拭子收到棉拭子样品后，500μL PBS溶解，样品振荡混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，经4℃10000r/min离心10 min,取上清液作为组织培养的接种材料，编号备用。组织脏器取待检样品 2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10 mL 细胞维持液混匀，4℃5 000 r/min离心15 min,取上清液转人无菌的1.5mL离心管中,编号备用。精液用维持液将精液作1：5稀释，4℃5000r/min离心10min，取上清液作为接种分离病毒的材料。2 SN/T 2733--20血液样品4 ℃ 5 000 r/min 离心10 min,用移液器吸出血浆（不要破坏白细胞层）,补充 PBS至原体积,轻轻倒转试管几次：4℃ 5000 r/min离心10 min，弃上清液（保留白细胞层）。加人等量无菌的去离子水，轻轻倒转试管几次，使血细胞溶解；或用 40 μA的超声波1 min打碎红血球，4℃ 5000