SB_T 10923-2012肉与肉制品中动物源性成分的测定 实时荧光PCR法.pdf

ICS67.120.01x00SB中华人民共和国国内贸易行业标准SB/T 10923—2012肉及肉制品中动物源性成分的测定实时荧光PCR法Identification of animal derived materials in meat and meat productsReal-time PCR method点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（报批稿）（本稿完成日期：2012年12月20日）XXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施发布中华人民共和国商务部 SB/T XXXXX—XXXX次目前言II1范围，规范性引用文件23术语、定义和缩略语3.1术语和定义3. 2缩略语原理4 25试剂和材料26仪器和设备3样品制备.73检验步骤，89结果判定，510测定下限511防止污染的措施5附录A（资料性附录)DNA提取裂解液配制6附录B（资料性附录）检测用引物及探针序列.附录C（资料性附录)检测靶基因参考序列. SB/T XXXXX—XXXX前 言本标准的附录A为资料性附录。本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准由中华人民共和国商务部提出并归口。本标准起草单位：商务部流通产业促进中心。本标准主要起草人：郑志明、郝瑞颖、张新玲、李乐、刘华琳、赵箭。本标准系首次发布的国内贸易行业标准。II SB/T XXXXX—XXXX肉及肉制品中动物源性成分的测定实时荧光PCR法1范围本标准规定了肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅和兔源性成分的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的定性检测。注：本标准中“肉及肉制品主要指鲜（冻）肌肉组织或经过初步加工的鲜（冻）生肉制品。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T1193基因检测实验室技术要求GB/T21103-2007动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法3术语、定义和缩略语3.1术语和定义3. 1. 1实时荧光 PCR real-time PCR实时荧光聚合酶链式反应。3. 1. 2Ct 值 cycle threshold value每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.2缩略语3. 2. 1DNA, deoxyribonuleic acid脱氧核糖核酸3. 2. 2FAM, carboxyfluorescein羧基荧光素1 SB/T XXXXX—XXXX3. 2.3TAMRA, carboxy tetramethyl rhodamine羧基四甲基罗丹明3.2.4Cytb, cytochrome oxidase subunit b细胞色素氧化酶亚单位b3. 2.5ROX, carboxy-X-rhodamine羧基-X-罗丹明3. 2. 6CTAB, hexadecyltrimethyl ammonium bromide十六烷基三甲基溴化铵3. 2.7Tris, tris (hydroxymethyl) aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷3.2.8EDTA, ethylene diaminetetraacetic acid乙二胺四乙酸4原理采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA的细胞色素氧化酶b亚基（Cytb）基因上畜禽各物种间序列差异而进行动物源性成分的检测。以GenBank上公布的猪（X56295）、牛（GU249568.1）、羊（AF010406）、马（JF511458.1）、驴（JF718884.1）、鸡（X52392）、鸭（EU755252）、鹅（AY552163.1）、兔（AJ001588）的Cytb基因序列为模板，设计并合成各自的特异性引物对及探针；利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提去除蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板，分别使用各物种的特异性引物对及探针进行实时荧光PCR扩增，并通过标记报告基因羧基荧光素（FAM）、萍灭基因羧基四甲基罗丹明（TAMRA)的探针进行特异性杂交。根据实时荧光PCR的扩增曲线和Ct值，对肉及肉制品中的动物源性成分进行检测。5试剂和材料5试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T27403-2008和SN/T1193的规定执行。除另有规定外，试剂应为分析纯，实验用水应符合GB/T6682的要求。DNA提取裂解液的配制方法可参考附录A的介绍。引物及探针序列参考附录B，