SN_T 3306.5-2013国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第5部分：布鲁氏菌.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3306.5—2013国境口岸环介导恒温扩增（LAMIP)检测方法第5部分：布鲁氏菌Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 5 :Brucellosis2013-03-01发布2013-09-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局电话40.50025.com余层查真伪 SN/T 3306.5—2013前言SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（I.AMP)检测方法》共分为5部分：-第1部分：鼠疫杆菌；-第2部分：产毒素霍乱弧菌;一-第3部分：志贺氏菌;一第 4部分：嗜肺军团菌；第 5部分布鲁氏菌。本部分为SN/T3306的第5部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：陆晔、田桢干、邱瑾、鞠志英、章琪、李强、方筠、李晓虹、何宇平、李平、卢钟山、王婷、阙飚、曹以诚、杜正平、陈洵。1 SN/T 3306.5—2013国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第5部分：布鲁氏菌1范围SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测布鲁氏菌病疑似样本、不明物质等样品中布鲁氏菌的环介导恒温扩增(LAMP)法。本部分适用于国境口岸布鲁氏菌的筛选检2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB 16885布鲁氏菌病监测标准GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用3缩略语下列缩略语适用于本文件。Betaine:甜菜碱Bst 酶:Bst DNA 聚合酶(大片段)[BstDNA polymerase(large fragment)eDNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)dNTP:脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside tripHosphate)EDTA：乙二胺四乙酸(ethylnediamineetraacetic acidpLAMP:环介导恒温扩增（loopmediated isothermial amplification)Triton X-100:聚乙二醇辛基苯4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测布鲁氏菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。5防污染措施防止污染措施应符合WS/T230-2002的规定。6技术概要根据布鲁氏菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，在特异性识别靶序列上的独立1 SN/T 3306.5—2013区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链含成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，产生副产物（熊磷酸镁），形成乳白色沉淀，可观查判断结果：另加人核酸显色液，可观察颜色变化判定结果。7试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1引物：布鲁氏菌检测用引物组，选取特异性的布鲁氏菌外膜蛋白25基因（OMP25）的序列，分析保守性，设计出能专一性鉴别布鲁氏菌的特异性引物组，该引物组由如下四条引物组成：外引物 1(F3,5-3):CGTCGGCTACGACCTGAA外引物 2(B3,5-3):ACCGGCCAGATCATAGTTCT内弓1物 1(FIP,5-3):FCGTCCAAGCCGTTGTTAAGCTttttCCCGGTTATGCCGTACCT内引物 2(BIP,5-3):GTGCCGGTCTCGAAGCCAAGttttTGTTGCCGTACTGGGTGTA7.2 DNA 提取液:含 20 mmol/L Tris-HCIl(pH 8.0)、2 mmol/L EDTA 和 1.2% Triton X-100。7.3dNTPs:每种核苷酸浓度 10 mmol/I。7.4 Bst 酶:8 U/μl。7.510 × ThermoPol 缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、100 mmol/I 氯化钾溶液、100mmol/L硫酸铵溶液、20mmol/1.硫酸镁溶液、