SN_T 4525.5-2016出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第5部分：克罗诺杆菌.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4525.5—2016出口食品中致病菌的分子分型MILST方法第5部分：克罗诺杆菌Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food--Part 5 :Cronobacter spp.2016-06-28 发布2017-02-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4525.5—2016前言！MLST方法》共分10个部分：SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型第1部分：沙门氏菌；-第2部分：金黄色葡萄球菌；第3部分：副溶血性弧菌；第4部分：霍乱弧菌；第5部分：克罗诺杆菌；一第6部分：化脓链球菌；第 7部分：空肠弯曲菌;一-第8部分：致泻性大肠埃希氏菌；一-第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第5部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国南京出人境检验检疫局。本部分主要起草人：王、陈颖、赵晓燕、蒋原、薛峰、赵晓美。1 SN/T 4525.5—2016MLST方法出口食品中致病菌的分子分型第5部分：克罗诺杆菌‧范围1SN/T4525的本部分规定了出口食品中克罗诺杆菌的分子分型MLST检测方法。本部分适用于出口食品中克罗诺杆菌的分子分型检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.40--2010　食品安全国家标准＇食品微生物学检验　阪崎肠杆菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范，食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1管家基因house-keeping genes所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的,其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因。3.1.2Tag DNA 酶 Thermus aquaticus DNA polymerase从 Thermus aquaticus 细菌中提取的耐热 DNA 聚合酶。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)MLST：多位点序列分型(multilocus sequence typing)ST:序列型(Sequence Type)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷Ltris(hydroxymethyl)aminomethane]4　原理MLST是通过测定多个管家基因中长度约为 470 bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编1 SN/T 4525.5—2016号,不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性。5试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1 Eα Taq DNA 聚合酶。5.2 dNTP:dATP、dTTP.dCTP,dGTP。5.3DNA提取试剂:DNA 提取试剂盒。5.4110 X Er Taq Buffer(20 mmol/L MgCl2)。5.5琼脂糖。5.6TAE缓冲液:2 mol/L Tris-HCl(pH 8.4),1 mol/L 乙酸，100 mol/L EDTA。5.7参考菌株：克罗诺杆菌ATCC29544。6仪器和设备6.1PCR扩增仪。6.2离心机。6.3核酸蛋白分析仪。6.4电泳仪。6.5分子凝胶成像仪。6.6微量移液器和灭菌吸头:10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL。6.7恒温培养箱。6.8恒温水浴锅。6.9天平。6.10灭菌三角烧瓶:500 mL、250 ml。6.11灭菌平Ⅲ:90 mmX15 mm。6.12灭菌试管：内径 3 mm，长5 cm。7检测程序对克罗诺杆菌 7对管家基因 atpD、fusA、glnS、