SN_T 2676-2010进出口粮谷中T-2毒素的检测方法 酶联免疫吸附法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2676—2010进出口粮谷中T-2毒素的检测方法酶联免疫吸附法Determination of T-2 in cereals for import and export-Enzyme-linked immunosorbent assay2011-05-01实施2010-11-01 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2676-2010言前本标准按照 GB/T 1.1--2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：孙静克、鲍蕾、张艺兵、吕宁、吴振兴、金莹、田娟、许艳丽。 SN/T 2676—2010进出口粮谷中T-2毒素的检测方法酶联免疫吸附法1范围本标准规定了进出口粮谷中 T-2 毒素的酶联免疫吸附检测方法。本标准适用于大麦、小麦、高粱、玉米中-T-2-毒素的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。瓦是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(苞括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法3 方法提要本方法的测定是基于竞争性酶联免疫反应-,用甲醇-水振荡提取粉碎样品中的 T-2毒素。处理后样品中的T-2毒素与T-2毒素酶标记物竞争结合至包被在微孔板上的抗体。通过洗涤除去微孔上未结合的 T-2毒素与T-2毒素酶标记物，然后加人反应底物，用酶标仪定吸光度，根据吸光度值得出试样中的 T-2 毒素含量。4试剂和材料除注明外，所用化学试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。4.1 T-2 毒素检测试剂盒(参见附录 A)。4.2 甲醇。4.3甲醇-水提取液：用甲醇和水以7：3的比例配制成提取液备用。4.4T-2 毒素标准品:纯度大于等于 98%。4.5T-2毒素标准品溶液的配制：用乙作为溶剂配制成200μg/mL的储备液，于一4℃条件下保存。4.6pH值为7.2的样品稀释用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)：分别称取0.55g磷酸二氢钠(NaH²PO4°H²O),2.85g磷酸氢二钠(NazHPO4·2H²O)和9g氯化钠，用水溶解并定容至1L。如果毒素含量较高，需要更高倍稀释时（大于1：7），应向此缓冲液中加人10%的甲醇溶液，以保证甲醇溶液的浓度为10%。5仪器和设备5.1 天平:感量0.01g。5.2 均质器。5.3涡旋混合器。5. 4 微量移液器:5μL～50 μL,10 μL～100 μL,0 μL～1 000 μL。 SN/T 2676—-2010多通道微量移液器：50μL～300μL。5.55.6容量瓶:10 mL,1 000 mL。5.7 酶标仪。5.8粉碎机。离心机:5 000 r/min。5.96试样的制备与保存试样的制备6.1将样品按四分法缩分至1kg，全部磨碎至颗粒可通过20目筛大小，混匀，均分成两份作为试样，分别装人清洁的容器内，密封，并标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。6.2试样的保存将试样于一5℃以下避光保存。7 分析步骤7.1　提取称取25g试样（精确到0.01g），加人125mL甲醇-水提取液（4.3），均质1min～2min,5000r/min离心10min。离心后取50μL滤液加入300μL样品稀释液，混匀。取 50μL进行酶联免疫测定，最后稀释倍数为35。高浓度的样品，毒素含量如超出标准曲线范围，可进一步稀释,直至样品中毒素浓度在标准曲线范围以内。7.2测定条件7.2.1操作条件所有操作应在室温下（20℃～24℃)进行，T-2毒素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(20℃～24℃)后方可使用。7.2.2洗板条件人工洗涤次数5次以上，每次加人洗涤液量为250μL，自动洗板可以预定5次。7.2.3酶标仪测定条件酶标仪测定波长为 450 nm。7.3测定步骤7.3.1将测定需用的微孔条插入微孔架，记录标准液和样液在微孔架上的位置。7.3.2吸取50 μL T-2毒素标准液（浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 ng/mL)和样液至各微孔。7.3.3吸取50μL T-2毒素酶标记物至各微孔，均匀混合，依次加人50μL T-2毒素抗体，混合，以封口膜将微孔覆盖防止试液挥发，于22℃～25℃黑暗避光处孵育1h。7.3.4倒出孔中液体，以250μL蒸馏水反复清洗微孔，重复操作3次以上，将微孔倒置在吸水纸上拍打数次，以保证完全除去微孔中洗液。2 SN/T 2676—20107.3.5迅速加人100μL底物至各微孔，于22℃～25℃黑暗避光处孵育30min7.3.6孵育完毕后加入100