实验溶菌酶的粗提取分离纯化及酶活力纯及分子量测定演示文稿.pptVIP

* 层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备: 层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。 当前第31页\共有60页\编于星期三\22点 * 层析设备 层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器 当前第32页\共有60页\编于星期三\22点 * 记录仪 当前第33页\共有60页\编于星期三\22点 现代化层析设备——AKTA 层析柱XK BPG 当前第34页\共有60页\编于星期三\22点 实验2.1 层析柱的填装 1.观摩 2.实验步骤 1）测定酶浓度（S-2） C(mg/ml)=A280/13 2）若填料载量为20mg/ml，计算拟纯化100mg 蛋白需要的填料量和量取量。 * 当前第35页\共有60页\编于星期三\22点 3）装柱要点： a. 用纯水将乙醇保存液置换 b. 柱头及柱底适配器确保无气泡，可用注射器推注赶气泡，并确保连接管路密闭无泄漏。 c. 填料倾倒入柱管内前先加入少量水覆盖柱底 d. 柱拆卸后填料务必回收，并保存于20%乙醇中。 * 当前第36页\共有60页\编于星期三\22点 二、酶的活力单位及酶活测定： 1. 酶活单位：1961年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（IU）规定为：在最适反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位。 当前第37页\共有60页\编于星期三\22点 * 2.酶的比活力： 每单位酶蛋白所含的活力单位数。 对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位/mg酶蛋白氮来表示； 对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。 很明显，比活力越大，酶的活力越大。 当前第38页\共有60页\编于星期三\22点 分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法。 测压法：产物中有气体，测气压增加量。 滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。 荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂 反应生成荧光产物可用此法。 旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。 除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。 3.具体测定方法 当前第39页\共有60页\编于星期三\22点 4. 回收率和纯化倍数 回收率＝ ×100％ 提纯后酶总活力 提纯前酶总活力 纯化倍数＝ 每次比活力 第一次比活力 当前第40页\共有60页\编于星期三\22点 * 实验2.2溶菌酶的活性测定 实验材料： 1. 枯草芽孢杆菌悬液 2. S1，S2 3. PBS等 4. 分光光度计、比色皿、计时器、离心机等 当前第41页\共有60页\编于星期三\22点 * 实验步骤： 1. 取6ml 菌悬液，3500rpm*5min，弃上清，沉淀 6ml PBS重悬。 2. 测定OD600并记录（吸光度0.5~1.0，若读数过高可适当稀释） 3. 测定样品准备（酶液务必在仪器等条件准备好，临测定前加入） 比色皿 1 2 3 4 PBS缓冲液/ml 5 - - - 细胞PBS悬液/ml - 5 4.8 4.8 酶液S1/ml - - 0.2 酶液S2/ml 0.2 当前第42页\共有60页\编于星期三\22点 * 实验步骤： 4. 酶活性测定，以①管（PBS）为对照，每隔30s 测定2,3,4管的OD600并记录 5. 酶活力及比活性计算： U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2 C(mg/ml)=A280/13 6. 纯化回收率及纯化倍数计算 时间（s） 0 30 60 90 120 150 180 2号 ? ? ? ? ? ? ? 3号 ? ? ? ? ? ? ? 4号 ? ? ? ? ? ? ? 回收率＝ ×100％ US2*V2 US1*V1 纯化倍数＝ S2比活力 S1比活力 当前第43页\共有60页\编于星期三\22点 实验溶菌酶的粗提取分离纯化及酶活力纯度及分子量测定演示文稿 当前第1页\共有60页\编于星期三\22点 优选实验溶菌酶的粗提取分离纯化及酶活力纯度及分子量测定 当前第2页\共有60页\编于星期三\22点 实验内容 1. 溶菌酶的粗提取 2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定 3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定 * 当前第3页\共有60页\编于星期三\22点 背景知识 溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-ac