SNT 1699.3-2006猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫吸附试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1699. 3--2006猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫吸附试验操作规程Protocol of indirect dot enzyme-linked immunosorbent assayfor the detection of porcine epidemic diarrhea2006-01-26 发布2006-08-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局酸码防伤 SN/T 1699.3—2006前 言SN/T1699分为三部分：猪流行性腹泻微量血清中和试验揉作规程；-猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验操作规程；猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫吸附试验操作规程。本部分为SN/T1699的第3部分。本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本部分主要起草人：陈茹、罗琼、林志雄、刘琳琳。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1699.3—2006引言猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒（PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病，临床表现与猪传染性胃肠炎(TGE)十分相似。1978 年，比利时首次证实该病病原为冠状病。由于缺乏稳定的疫苗生产，该病已成为欧、亚洲养猪业发达的国家和地区猪病防治的重点研究对象，并被列入我国进境动物二类传染病名录。PED在流行病学、临床表现和病毒形态等方面与TGE无显著区别,确诊主要借助特异性血清学和分子生物学方法。运用间接法斑点酶联免疫吸附试验(Dot-FLISA)能快速检测到感染动物血清中存在的PEDV抗体，尤其适用于大批量样品的初筛检测。= SN/T 1699. 3--2006猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫吸附试验操作规程1 范围SN/T1699的本部分规定了猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫吸附试验检测方法本部分适用于猪流行性腹泻病毒抗体的检测。亦可用于本病的检疫、疫情监测和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1699的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6682分析实验室用水规格及试验方法原理3斑点酶联免疫吸附试验是一种免疫酶标记技术，其原理与步骤与常规酶联免疫吸附试验(ELISA)基本相同，不同之处在于：将固相吸附载体用固相化基质膜代替，用于吸附抗原或抗体，并选用不溶性的供氢体做为显色底物，结果以在基质膜上出现有色斑点来判定。缩略语4下列缩略语适用于SN/T-1699的本部分4. 1Dot-ELISA斑点酶联免疫吸附试验。4.2HRP-SPA辣根过氧化物酶标记的葡葡球菌A蛋白，5设备和器材5.1 摇床。5.2恒温培养箱。5.3可调单道、八道微量移液器和吸头(10 μL、200 μL)5.4硝酸纤维素微孔滤膜(0.22 μm)。5.5微量细胞培养板（96孔）。5.6蒸汽消毒器。5.7手术剪、镊子、铅笔(HB)、直尺。6 试剂本部分使用的试剂除特殊规定外，均为分析纯试剂。 SN/T 1699.3-20066.1 水试验用蒸馏水应符合GB/T 6682关于二级水的规定。6.2 溶液0.01 mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液、封闭液、洗涤液，底物液。配制方法见附录A。6.3抗原由指定单位提供，按说明书使用；或参见附录B制备。6.4 血清6.4.1标准阳性血清（一20℃冻存备用），由指定单位提供。6.4.2标推阴性血清（20℃冻存备用），由指定单位提供。6.4.3待检血清：无菌采集待检动物血液，分离血清，不加任何防腐剂。6.5 HRP-SPA商品化生化试剂。使用前按说明稀释成工作浓度。7操作方法7.1制备诊断膜用铅笔在微孔滤膜上划5mmX5mm方格，蒸馏水漂洗一次,室温(18℃～25℃)晾干,每小格点1 μL抗原溶液(1 mg/mL),室温自然于燥，置封闭液中，在脱色摇床上室温缓慢振荡漂洗 1 h,取出用蒸馏水漂洗三次，室温自然干燥后，立即使用，或用保鲜袋封好置4℃备用。7. 2间接法 Dot-ELISA 操作步骤7.2.1 将待检血清、标准阳性血清和标准阴性血清用 0.01 mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液做 1 ：100稀释。将诊断膜剪成5mm×5mm大小的小片，按每孔一片置96孔细胞培养板中。7.2.2按表1加人100μL/孔稀释的血清,每份血清做双孔反应，37℃恒温培养箱内反应1h。7.2.3表196孔板检测加样图1112