SN_T 2622-2010柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2622—2010柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Xanthomonas axonopodis pv. citri2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局微动 SN/T前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国四川出境检验检疫局、四川省植物检疫站。本标准主要起草人：何万兴、向勇、何天江、宁红、范京安、何羽。一 SN/T 2622--2010柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了进出境植物检疫中桔溃疡病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境芸香科植物及其产品感染柑桔溃疡病菌的鉴定。2原理柑桔溃疡病菌，Xanthomonasaronopodis pv.citri（Hasse）Vauterin et al.1995,异名X.campes-trispv.citri（Hasse）Dye1978，属原核生物总界Procaryotae，细菌界Bacterium，薄壁菌门Gracili-cutes，黄单胞杆菌科Xanthomonadaceae，黄单胞菌属Xanthomonas，是为害芸香科植物叶片、枝条、果实的重要病原菌，其为害引起的典型症状及病原菌形态特征等信息参见附录A。该病原菌的为害症状、形态特征、致病性反应、免疫学特性、PCR特异性反应是制定本标准的依据。3试剂除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。3.1分离用试剂次氯酸钠（NaC1O）、氯化钠（NaCI）、蛋白陈、蔗糖、磷酸氢二钾（K,HPO。）、硫酸镁（MgSO7HzO)、琼脂、盐酸(HC1)、95%乙醇等。培养基配方详见附录B。3.2PCR、ELISA检测所用试剂PCR检测试剂及配制见附录C,ELISA试剂及配制见附录D。4仪器及用具超净工作台、天平、高压灭菌锅、培养箱、摇床、生物显微镜、高速台式离心机、PCR扩增仪、水平电泳仪、凝胶成像系统、PCR反应管、离心管、酶联板、微量移液器、移液器、剪刀、接种针、子、培养皿、三角瓶、试管、酒精灯、吸管、自封式塑料袋等。5实验室检验5:1症状观察观察待检样品是否有柑桔溃疡病菌为害的症状，柑桔溃疡病典型症状参见附录A第A.5章。对有柑桔溃疡病典型症状样品可任选分离鉴定、PCR或间接ELISA三者之一进行检测，对无柑枯溃疡病典型症状或可疑柑桔溃疡病典型症状的样品选用PCR或间接ELISA进行检测。5.2柑桔溃疡病菌的分离鉴定5.2.1分离培养将待检样品用3%~～5%的次氮酸钠（NaCIO)表面消毒处理5min～15min，然后无菌水冲洗三次，1 SN/T2622-—2010无菌条件下晾干。取样品病健交界处约2mm×3mm小块组织放入0.2mL无菌水中，用灭菌玻璃棒捣碎，在室温下浸泡5min～10min，使组织中的细菌流入水中配成悬浮液，将悬浮液在蔗糖蛋白陈培养基平板上划线，28℃培养2d～4d，观察菌落形态和病原菌形态特征，柑桔溃疡病菌菌落形态和菌体特征参见附录A第A.6章。5.2.2致病性测定用已知的柑桔溃疡病菌菌株作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，将待测纯培养菌株及阳性对照从培养基上刮下后用无菌水配成10°CFU/mL～108CFU/ml.菌悬液，针刺接种到健康的甜橙类柑桔新梢叶片上，28℃～30℃、相对湿度95%～100%条件下培养7d～14d，观察是否有柑桔溃疡病典型症状。5.3PCR检测用已知的柑桔溃疡病菌菌株作灯阳性对照，非柑枯溃疡病菌的植物病原细菌作为阴性对照，双蒸水作为空白对照，PCR制样及检测方法见附录5.4间接ELISA检测制样及检测方法见附录D。6结果评定6.1通过分离培养进行检测的，分离培养的菌落形态及荫体形态符合附录A第A.6章描述，且分离纯培养物经PCR、间接ELISA或致病性测定三者、检测为阳性样品判定为带菌样品。否则不带有柑桔溃疡病菌。6.2通过PCR或间接ELISA检测的，PCR戴问接ELISA检测结果为阳性，样品判定带有柑桔溃疡病菌。否则不带有柑桔溃疡病菌。7样品保存及处理检出带菌样品以及所分离随株至少保存3个月并做好记录，以备复验、谈判和仲裁之用。其他不需保存的样品及检测过程中产生的废物、废水等应集中销毁，用具应进行灭活处理。样品及菌株保存期满后做灭活处理。a SN/T2622—2010附录A(资料性附录)柑桔溃疡病菌（Xanthomonasaxonopodispv.citri)相关资料A.1英文名Citrus canker.A.2学名及分类地位Xanthomonasazonopodispv.citri，