NY 684-2003犬瘟热诊断技术.pdf

ICS 11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 684-2003犬瘟热诊断技术Diagnostic techniques for canine distemper2003-07-30发布2003-10-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 684-20031前育本标准的附录 A 为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。本标准主要起草人：田克恭、王宏伟、遇秀玲、陈西钊、王传彬。 NY/T 684—2003犬瘟热诊断技术1 范围本标准规定了犬瘟热(CD)的临床诊断、犬瘟热病毒(CDV)的分离与鉴定、免疫酶试验和免疫酶组织化学方法等诊断技术。本标准适用于犬瘟热的诊断。2临床诊断要点2. 1临床症状CD 的临床表现多种多样,与 CDV 的毒力,环境条件,宿主的年龄、品种及免疫状态有关。病犬体温升高至40℃以上，鼻流清涕至脓性鼻汁，脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状，腹下可见米粒大丘疹。病程长的犬足枕角质层增生。病后期 CDV 侵害大脑时则出现神经症状,头、颈、四肢抽搐。2.2 病理变化CDV 为泛嗜性病毒,对上皮细胞有特殊的亲和力,因此病变分布非常广泛。新生幼犬感染 CDV 通常表现胸腺萎缩。成年犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。表现神经症状的犬通常可见鼻和脚垫的皮肤角化病。中枢神经系统的大体病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。CDV 的包涵体通常呈嗜酸性,位于胞浆内,直径 1 μm～5 μm,可在粘膜上皮细胞、网状细胞、白细胞、神经胶质细胞和神经元中发现。核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。3 病毒分离与鉴定3.1材料准备3. 1. 1 试剂改良最低要素营养液(DMEM)培养基，配方见第A.1章。 非洲绿猴肾细胞(Vero 细胞)。标准阳性血清：CDV单克隆抗体，中和抗体效价1：1024。标准阴性血清:无 CDV 感染的犬血清。3. 1. 1.5新生牛血清处理:用无血清 DMEM 洗涤细胞两次,加人培养液二分之一量的新生牛血清，37℃吸附1 h。吸附后的新生牛血清分装,置一20℃备用。 青霉素、链霉素。3.1.2器材a)细胞培养瓶;b）吸管;c)二氧化碳培养箱；d）37℃恒温水浴箱；e）普通冰箱及低温冰箱；f)离心机及离心管；研磨器械;g）h)普通光学显微镜；1 NY/T 684—2003i）微量加样器,容量 5 μL～50 μL,50 μL～200 μL;j）0.45 μm微孔滤膜。3.1.3样品CDV存在于病犬心脏、肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用无血清DMEM制成20%组织悬液,3000r/min离心30 min,取上清。10 000r/min离心20min，取上清用于CDV分离。3.2操作方法3.2.1细胞培养用含 8%已处理的新生牛血清的DMEM培养基，在37℃培养Vero细胞。每3d～4d传代一次，细胞长成单层时，用于 CDV分离。3.2.2病料接种将 0.1 mL处理好的组织悬液接种 Vero细胞,33℃吸附1 h，加入无血清 DMEM继续培养 5d~7 d,观察结果。3.2.3结果观察CDV 感染 Vero 细胞 4 d～5 d 表现为细胞变圆、胞浆内颗粒变性和空泡形成,随后形成巨细胞和合胞体,并在胞浆中出现包涵体。若第一次接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代。如仍无细胞病变,则判为 CDV检测阴性。3.2.4　CDV的鉴定将出现细胞病变的细胞培养物，按第 4章的方法制备细胞涂片，用.CDV单克隆抗体进行鉴定。4 免疫酶试验4.1材料准备4.1.1试剂磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见第A.2章。抗原涂片的制备:将 CDV接种 Vero细胞,接种后 5 d～~7 d,病变达 50%~～75%时,用胰蛋白酶消化分散感染细胞,PBS洗涤三次后，稀释至 1×10°个细胞/mL。取印有 10 个～40 个小孔的室玻片，每孔滴加10 μL。室温自然干燥后，冷丙酮（4℃)固定 10 min。密封包装，置20℃备用。标准阳性血清：CDV单克隆抗体，中和抗体效价1：1024。标准阴性血清:无 CDV 感染的犬血清酶结合物：HRP标记的葡萄球菌A蛋白（SPA)。底物溶液：配制见第A.3章。4.1.2器材a）普普通光学显微镜；b)[印有10个～40个小孔的室玻片；c）微量加样器，容量5μL～50 μL；d）37℃恒温培养箱或水浴箱。4.1.3样品采集被检犬血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或30℃保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号,并用PBS作10倍稀释。4.2操作方法4.2.1取出抗原涂片,室温干燥后,滴加 10 倍稀释的待检血清和标