SN_T 2617-2010冬生疫霉病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2617—2010冬生疫霉病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phytophthora hibernalis Carne2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局敬动 SN/T2617—2010前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：吴品珊、杜洪忠、严进。 SN/T2617—2010冬生疫霉病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中冬生疫病菌Phytophthora hibernalisCarne的检疫鉴定方法。本标准适用于针对冬生疫霉病菌寄主的苗木、枝条、枝叶、果实以及夹带土壤中的冬生疫霉病菌检疫鉴定。2原理根据冬生疫舞病菌在寄主上的症状、形态学特征和PCR特异性扩增片段为鉴定依据。该病菌的其他相关资料参见附录A。3仪器3.1生物显微镜，体视显微镜。3.2光照生物培养箱。3.3高压灭菌器。3.4高速离心机。3.5PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。4试剂、材料和培养基4.1试剂4.1.1匹马藓素，利福平钠盐，苯菌灵，恶灵，碳酸钙（CaCO），β-谷醇，色氨酸，硫氨，氯化钙(CaCl²·H,O),次氮酸钠(NaCIO)。4.1.2琼脂糖，SDS（十二烷基硫酸钠），Tris-HCl，氮化镁，盐酸，EDTA（乙二胺四乙酸四钠盐），氢氧化钠，乙酸钠，氯化钠，Tris，CTAB十六烷基三甲基溴化铵），TAE，无水乙醇，苯酚，兰氯甲烷，异丙醇，异戊醇,SYBRGreenI核酸染料。4.1.3蛋白酶K,TagDNApolymerase，dNTP,DNA分子量Marker。4.1.4PCR引物PHIB1/PHIB2。4.2材料琼脂，V8液，雪松（Cedrusdeodara）松针，柑橘（Citrusspp.）叶片，胡萝卜，玉米油。4.3培养基本标准所用的培养基参见附录B。 SN/T 2617—20105鉴定方法5.1症状检查重点观察柑橘果实是否有褐色病变，叶和小枝是否枯萎；杜鹃属植物，观察叶片是否有深褐色病斑，或整个叶片和叶柄变褐；玫瑰受害症状为叶部和小枝枯萎，茎基部有深紫色到黑色病斑；其他寄主上为根部腐烂或溃疡。参见附录A。5.2分离培养和诱集5.2.1分离培养植物根、茎组织在流水下冲洗h～4h，在病健交界处或变色部位切取边长为5mm～10mm的样品，灭菌滤纸吸干水分，放于选择性赔养基上取柑橘果实表皮、植物叶片等其他组织的病健交处5mIrmm，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分，放于选择性培养基上。或用0.5%次氮酸钠消毒2mir5min，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分，放于胡萝卜丝培养基或稀释5倍或ao倍的V8培养基上。16℃～20℃黑暗培养1周～2周。如有真菌菌落出现，转到V8培养基上，16℃～20℃12h光照/12h黑暗培养。5.2.2土壤诱集称取25g土壤或介质，壤碾碎、去杂放入灭菌烧杯中，加人无菌水将土壤或介质润湿，封口，置于17℃~20℃黑暗放置。5d～7d后在烧杯中加入灭菌水，使水层高4.0cm。取雪松松针或柑橘叶片，无菌水清洗后漂放在水面或浸在水中，16℃～20℃诱黛2d～3d后开始检查，取有失绿或变鱼的松针或叶片,无菌冲洗，灭菌滤纸吸干水分，放于选择性～2周。培养基或胡萝卜丝培养基上，1620C黑暗捂养1周5.2.3孢子培养将长有分离菌的V8培养基协成小块，放在灭菌培养Ⅲ中，加入弯许灭菌水使培养基表面有游离水，20℃光照培养，1d2d后观察如有孢子生生戚，可将暗养孤放授置4℃，观察游动孢子产生。5.2.4卵孢子培养将分离菌转至卵孢子培养基上，7℃～8℃培养2周～4周，观察有否卵孢子形成。5.3分子生物学鉴定5.3.1DNA提取取疑似寄主植物病组织或收集分离到的真菌菌丝，CTAB法提取核酸。参见附录C。5.3.2PCR检测P.hibernalis的PCR检测方法参见附录C。2 SN/T2617—20106鉴定标准6.1菌落特征在V8培养基上生长速度较慢（4mm/d～8mm/d），菌落平贴至中度的蓬松，呈玫瑰花瓣状，花瓣状区域较宽且圆。6.2病原形态P.hibernalis的孢子囊长卵圆形或椭圆形，易脱落，带有较长的孢囊柄，顶部具有不完全的乳头状突起，通常基部锥形、顶部近半乳突处最宽。孢子大小（29μm~53μm）求（14μm~22μm）（平均40μm×19m），长宽比较大为1.8~2.4平均2.1），孢囊柄长23um~73μm。孢囊梗不分枝或窄的长分枝，或形成不规则答轴武长侧枝。孢手囊低温萌发释放游动孢子。病菌不产生厚垣孢子，一般无菌丝膨大体。P.hibernalis为