SN_T 2777-2011输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的巢式RT-PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2777—2011输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的巢式RT-PCR 检测方法Detection of epidemic hemorrhagic fever virus(EHFV)in imported rodents-Method of nested RT-PCR2011-07-01实施2011-02-25 发布中华人民共和国发布K国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2777—2011前言本标准按照 GB/T 1.1-2009规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郑剑宁、裘炯良、胡群、吴薇、黄彤文、杨苹、王燕。 SN/T 2777—2011输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的巢式 RT-PCR 检测方法范围1本标准规定了国境口岸输人性啮齿动物携带流行性出血热病毒的生物安全要求、检测方法、结果的报告、阳性结果处置。本标准适用于出人境检验检疫机构对输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的检测，对口岸发现的啮齿动物及食虫目动物中的普通、大麝、臭等检测流行性出血热病毒也可参照执行。E2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3. 1啮齿动物rodents哺乳纲中种类最多，分布最广的一类动物，包括啮齿目和兔形目。一般体型较小，数量多，繁殖快，适应力强,其中多数可携带流行性出血热病毒3. 2输入性啮齿动物imported rodents通过人境交通工具、集装箱、货物、行李及邮包携带入境的啮齿动物。3.3流行性出热 epidemic hemorrhagic fever; EHF由啮齿动物携带的汉坦病毒引起的伴有肾综合征的一类出血热的综合名称，主要包括姬鼠型及家鼠型流行性出血热及流行性肾病。3.4流行性出血热病毒epidemic hemorrhagic fever virus；EHFV属布尼亚病毒科，汉坦病毒属,是一组单股负链RNA病毒,由大（L）、中（M）、小(S)3个片段组成，分别编码病毒的 RNA 依赖的 RNA 多聚酶(L）、外膜蛋白 G1、G2 和核衣壳蛋白（N）,为流行性出血热的病原体，常见有汉滩病毒型和汉城病毒型。4生物安全要求实验室操作应在生物安全ⅡI级(BSL-2或 ABSL-2)实验室中进行，实验完毕后对实验中所用物品及实验台进行灭菌消毒，以保证实验室工作人员及实验室安全。1 SN/T 2777—20115　巢式 RT-PCR5.1器材与试剂5.1.1器材PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、电子分析天平、紫外观察灯、恒温培养箱、普通冰箱、超低温冰箱（一80℃）、组织研磨器、外排式生物安全柜、液氮罐、离心机和离心管、常温摇床、PCR管、剪刀、镊子。5.1.2 试剂 水应符合 GB/T 6682中级水的规格。用于 PCR(包括核酸抽提)时所用的水应是无RNA酶的水。 Taq DNA 聚合酶浓度为 5U/μL，一20 ℃保存。AMV逆转录酶浓度为10 U/μL，一20℃保存。 RNase 抑制剂(RNasin)-20℃保存。 dNTP含 dCTP、dGTP、dATP 和 dTTP,浓度均为 10 mmol/L。5. 1.2.6 20 μmol/L 引物.1逆转录引物序列5′-TAGTAGTAGACTCC-3′.2通用外引物序列5-AAAGTAGGTGITA YATCYTIACAATGTGG-35′-GTACAICCTGTRCCIACCCC-3.3汉滩病毒引物序列5-GAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGC-35′-GGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC-3′.4汉城病毒引物序列5′-GTGGACTCTTCTTCTCATTATT-35-TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG-3无水乙醇分析纯,无 DNA 酶和 RNA 酶,使用前预冷到一20℃。2 SN/T 2777—20115. 1.2.8 病毒标准株流行性出血热病毒标准株（由浙江省疾病预防控制中心提供)1）5.1.3试剂配制 变性液双蒸水 58.6 mL、异硫氰酸胍 50.0 g、0.75 mol/L柠檬酸钠（pH7.0)17.6 mL、10%Sarcosyl26.4 ml. DEPC 水双蒸水加入焦碳酸二乙酯（DEPC)至终浓度0.01%（体积分数），室温放置过夜后在120℃下高压灭菌 30 mi