SN_T 4865-2017大豆拟茎点种腐病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4865—2017大豆拟茎点种腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phomopsis longicolla Hobbs2018-03-01实施2017-07-21发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伙 SN/T4865-2017前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈雪娇、李云飞、宗凯、姚剑、段维军、孙娟娟、郑海松。 SN/T 4865—2017大豆拟茎点种腐病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了进出境大豆种子及其夹带的植物残体中大豆拟茎点种腐病菌（PhomopsislongicollaHobbs)的检疫鉴定方法，本标准适用于大豆拟茎点种腐病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3基本信息学名：PhomopsislongicollaHobbs分类地位：半知菌亚门Deuteromycotuna，腔孢纲Coelomycetes，球壳孢目Sphaeropsidales，球壳孢科Sphaeropsidaceae，拟茎点霉属Phomopsis。其有性态为间座壳属，自然界内未发现。传播途径：随带菌种子、植株或残体的调运作远距离传播。大豆拟茎点种腐病的地理分布、寄主、为害状等信息参见附录A。4原理以大豆拟茎点种腐菌培养性状、形态特征及实时荧光PCR检测结果作为检疫鉴定的主要依据，寄主、地理分布及为害症状作为辅助鉴定依据5仪器和用具5.1仪器生物显微镜（带显微照相装置）、体式显微镜、超净工作台、电子天平、光照培养箱、高压灭菌锅、实时荧光PCR仪、高速冷冻离心机、金属浴、冰箱、移液器等。5.2用具培养皿、烧杯、三角瓶、镊子、手术刀、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯、挑针、滤纸、标签等。6试剂和培养基6.1试剂75%酒精、85%乳酸、1%次氯酸钠、实时荧光PCR反应预混液、去离子水等。除另有规定外，所有1 SN/T 4865—2017试剂均为分析纯。6.2培养基马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：称取马铃薯浸粉3g，葡萄糖20g，琼脂粉18g，加人1000mL蒸馏水后加热搅拌溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃后倒平板。酸性马铃薯葡萄糖培养基（APDA)：按照PDA配方配制，高压灭菌后冷却至50℃，用过滤除菌的85%乳酸调节pH至4.5后倒平板。7抽样方法按照SN/T2122中的规定进行抽样。8鉴定方法8.1症状检查搜集并检查样品中夹带的豆荚或茎秆上是否有沿着茎秆成行排列的黑色斑点，观察种子是否存在皱缩、延长、开裂、扁平状，是否覆盖有白色霉层。8.2保湿培养8.2.1种子保湿培养选取疑似感病样品，用1%次氯酸钠处理60s进行表面灭菌，无菌水漂洗3次后，放在垫有三层灭菌湿滤纸的培养皿中，25℃～28℃12h光照12h黑暗交替条件下保湿培养7天以上，观察是否出现白色菌丝。8.2.2APDA培养挑取少量白色菌丝转到APDA上，25℃～28℃12h光照12h黑暗交替条件下培养，长出典型菌落和产孢结构后，转接至PDA培养基上，待长出分生孢子后，观察分生孢子器、分生孢子梗、产孢结构及分生孢子的形状，并测量大小。8.3实时荧光PCR检测采用特异性引物探针pltef-F/pltef-R/pltef-P对分离出的疑似菌株DNA进行实时荧光PCR检测，用大豆拟茎点种腐菌株作阳性对照，用非大豆拟茎点种腐菌的植物病原细菌DNA作阴性对照，用无菌水作空白对照，进行实时荧光PCR扩增（见附录B）。9病菌形态特征大豆拟茎点种腐病菌的培养性状、形态特征及与近似种的区别见附录C。10结果判定如分离菌的形态特征与附录C中描述的大豆拟茎点种腐病的特征相符，且实时荧光PCR检测结果为阳性，即可判定为大豆拟茎点种腐病菌PhomopsislongicallaHobbs。2 SN/T4865—201711样品与菌种保存分离得到的大豆拟茎点种腐菌转接在PDA培养基斜面上，待斜面表面长满菌丝后，置于4℃保存，定期转接。有条件可进行冷冻干燥保存。检出大豆拟茎点种腐菌的样品妥善保存6个月。保存期满灭活处理。 SN/T4865—2017附录A（资料性附录）大豆拟茎点种腐病菌相关资料A.1分布亚洲：韩国、中国。美洲：美国、阿根廷。欧洲：意大利