SN_T 4731-2016冷杉枯梢病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4731—2016冷杉枯梢病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Gremmeniella abietina (Lagerberg) Morelet2016-12-12发布2017-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4731—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李彬、粟寒、焦彬彬、王颖、李晓琪、吴翠萍、安榆林。 SN/T 4731—2016冷杉枯梢病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了冷杉枯梢病菌(Gremmeniellaabietina）检疫鉴定方法。本标准适用于进境冷杉、落叶松、云杉和松属等寄主植物及其植物产品中冷杉枯梢病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方3基本信息学名：Gremmeniellaabietina（Lagerberg）Morelet.无性态：Brunchorstia pinea （P.Karsten）Hohnell分类地位：真菌界（Fungi)、子囊菌门mycota子囊菌纲（Asomycetes）、柔膜菌目（Helotia-les）、柔膜菌科（Helotiaceae）、格瑞盘菌enmmeniella冷杉枯梢病菌的相关资料参见附4原理冷杉枯梢病菌的培养性状、形态学特征和分子生物学特性是鉴定该病原菌的主要依据。5仪器设备、用具及试剂5.1主要仪器设备生物显微镜、体视显微镜、超净工作台、灭菌锅、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、高速冷冻台式离心机、纯水仪、PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪，凝胶成像系统、水浴槽、天平（感量：0.001g)等。5.2主要用具样品袋、标签、放大镜、培养血、载玻片、盖玻片、三角瓶、试管、烧杯、手术刀、手术剪、镊子、研钵、量筒、吸管、酒精灯、滤纸、各种量程的可调移液器（2μL，10μL，20μL，100μL，200μL,1000μL）、各种吸头(10μL,200μL,1000μL)、PCR反应管（0.2mL,0.5mL)、离心管(0.2mL,0.6mL,1.5mL)等。5.3主要试剂和培养基除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682。 SN/T 4731—20165.3.1吴表面消毒试剂1%次氯酸钠。5.3.2DNA提取试剂、PCR试剂及凝胶电泳试剂参见附录 C。5.3.3V8汁麦芽提取物培养基V8 蔬菜汁 200 mL,麦芽提取物 20 g,琼脂 20 g,蒸馏水定容至 1 000 mL,调整 pH值至 5.2,121 ℃高压灭菌20min。5.3.4马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，调整pH值至5.6,121℃高压灭菌20min。5.3.5小麦培养基小麦种子10g，25mL蒸馏水，121℃高压灭菌20min。6现场检疫6.1抽样方法按SN/T2122进行抽样。6.2现场查验重点检查寄主植物的树芽、针叶、枝条、茎干和树皮等部位。观察顶芽是否有坏死斑、枯死症状；针叶是否呈红色至棕褐色，从基部向顶端延伸，易脱落；枝条基部是否会产生溃疡斑，枝条生长畸形，有丛枝现象。检查针叶和顶芽的基部、开裂的树皮是否有深褐色至黑色的子座状斑点；潮湿条件下在树皮、针叶和枝条表面是否含有奶油色或浅灰色子实体。将疑似感病样品带回实验室作进一步检测。7病原菌鉴定7.1 症状检查7.1.1植株症状检查冷杉枯梢病菌在寄主植物的树芽、针叶、枝条、茎干和树皮等部位都可以产生明显的症状，发病严重时，在顶芽、枝条的树皮上可以产生分生孢子器和子囊盘（参见图A.la、b、c）。分生孢子器通常在针叶和顶芽的基部形成，也可深埋于树皮中；子囊盘通常出现在树皮和针叶基部的表面上，不规则地散生在枯死的枝条和针叶组织上。7.1.2直接镜检将有成熟子实体的病枝或针叶置于体视显微镜下检查，挑取病部子实体制成玻片或切片后进行镜检，观察子实体及病原孢子的形态特征。2 SN/T 4731—20167.1.3保湿培养将有上述症状但无子实体的组织，进行保湿培养。将枝条或针叶置于密闭的塑料盒或袋中，15℃～17℃下每天16h光照/8h黑暗交替培养。待发现子