NY_T 2595-2014大豆品种鉴定技术规程 SSR标记法.pdf

ICS 01.040.67B 23NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2595—2014大豆品种鉴定技术规程SSR分子标记法Identification of soybean varietiesSSR marker method2014-06-01实施2014-03-24发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 2595—2014目次前言范围12规范性引用文件3术语和定义1原理·5仪器设备及试剂6溶液配制7引物..8操作步骤29等位基因数据采集10判定方法…仪器设备及试剂附录A（规范性附录）溶液配制·附录B(规范性附录)8附录C(规范性附录)核心引物10 NY/T 2595—2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归口。本标准起草单位：黑龙江省农业科学院作物育种研究所、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：李冬梅、刘平、陈立君、唐浩、孙连发、迟永芹、王翔宇、马楠= NY/T 2595—2014大豆品种鉴定技术规程SSR分子标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列（Simplescquenccrepeats，SSR）标记进行大豆[Glycinema.r（L.）Merr.品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。本标准适用于大豆SSR标记分子数据的采集和品种鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样NY/T2594一2014植物品种鉴定DNA指纹方法总则GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则GB/T19557.4植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南大豆3术语和定义NY/T2594-一2014界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3. 1核心引物coreprimer多态性、稳定性、重复性等综合特性好，用于DNA指纹鉴定的一套引物。核心引物作为统一用于DNA指纹数据库构建和品种鉴定的引物，可保证不同实验室数据具有可比性。3. 2参照品种reference variety参照品种指对应于SSR位点不同等位基因的一组品种。参照品种用于辅助确定待测样品等位基因的大小，校正仪器设备的系统误差。4原理SSR广泛分布于大豆基因组中，不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。由于每个SSR位点两侧的序列一般是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的序列设计-对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。在电泳过程中，主要由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定大豆品种。5仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制溶液配制方法见附录B。7 引物引物相关信息见附录C。1 NY/T2595—20148操作步骤8.1样品准备8.1.1对于种子样品的分样和保存，按GB/T3543.2的规定执行。8.1.2每份样品中至少随机抽取5个个体，混合分析，对一致性差的样品，应分别随机抽取10个以上的个体，每个个体单独分析。8.2DNA提取8.2.1叶片DNA的提取取0.3g新鲜幼嫩叶片卷好放入2mL离心管中，并置于液氮中30s后，迅速取出，加液氮研磨至粉末，加750μuL预热（65℃）的DNA提取液，摇匀；将离心管置人65℃恒温水浴锅45min～60min，在此期间，每隔10min颠倒混匀1次；取出离心管，冷却至室温；加人等体积的氯仿一异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，12000g离心10min；转移上清液至1.5ml离心管中，加人0.6倍体积的异丙醇（一20℃），轻缓颠倒混匀，置一20℃的冰箱中至少1h；12000g离心5min，弃上清，加500ul75%乙醇，洗涤沉淀2次，每次10min；室温风干，加100μl超纯水溶解沉淀。检测DNA浓度，将DNA稀释到200ng/μL，20℃条件下保存备用。8.2.2种子提取DNA方法将研磨好的豆子装于2ml.离心管中，加人200μL提取缓冲液（Extractbuffcr）、40μlSDS（10%），涡旋5s混匀，60℃水浴30min，每隔10min颠倒1次，水浴后加人100μl醋酸钾（5M/L），涡旋5s，冰浴30min，冰浴后加人等体积的Tris平衡酚/氯仿（1：1），涡旋20s，12000g离心10min，离心后取上清，加人等体积的氯仿，涡旋20s，120