SN_T 1501-2015野兔热检疫技术规范.pdf

5中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1501—2015代替SN/T1501—2004野兔热检疫技术规范Quarantine protocol for tularemia2016-01-01实施2015-05-26 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1501—2015前言本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1501-2004《野免热病原分离鉴定操作规程》。本标准与 SN/T 1501相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：增加临床诊断；增加聚合酶链反应(PCR)和荧光聚合酶链反应（荧光PCR);-删除了细菌生化试验，具体内容在附录A中介绍。本标准修改采用OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2008版）（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals)中第 2.1.18 章。本标准与OIE第2.1.18章相比，主要技术差异如下：~本标准等同采用OIE规定的病原分离鉴定和试管凝集试验；本标准增加了OIE中提及但没有详细操作规程的聚合酶链反应(PCR)和荧光聚合酶链反应(荧光PCR)的具体试验步骤;本标准未采纳OIE中提及但没有详细操作规程的免疫荧光（FAT）和酶联免疫吸附试验(ELISA)。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国山西出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局。本标准主要起草人：唐泰山、高峰、廉慧锋、张吉红、黄素文、方绍庆、张常印、张睿、王凯民、姜焱、陈国强、祝长青。 SN/T 1501—2015野兔热检疫技术规范1范围本标准规定了野兔热（土拉杆菌病)的临床诊断、土拉杆菌的显微镜检查、细菌培养、聚合酶链反应、试管凝集试验和动物试验等技术要求。本标准适用于进出口动物及其产品中野免热的检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682．分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1088布氏杆菌检疫技术规范SN/T 1193基因检验实验室技术要求SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范3生物安全和防污染措施野兔热是农业部规定的二类动物疫病，其病原为土拉杆菌，该菌的大量活菌操作和动物感染试验需在生物安全3级实验室进行，样本的病原菌分离纯化、生化试验、免疫学试验、PCR的核酸提取、涂片、显微镜观察等的样本检测操作需在生物安全2级实验室进行，非感染材料的实验可在生物安全1级实验室进行。检验过程的生物安全措施应符合GB19489和SN/T2025，检验过程的基因防污染措施应符合 SN/T 1193。4临床诊断野兔热简介参见附录 A,野兔热的发病症状与病理变化参见附录B。5 实验室诊断5.1样品采集5.1.1对死亡或濒死动物，无菌采取病变器官内外炎性、纤维素性或出血性渗出物、全血及肝、脾、骨髓、肾、肺、淋巴结等样品。对活动物，采集全血、淋巴结或淋巴液、穿刺液等样品。对动物产品，可采集内脏组织、淋巴结、骨髓、肉或皮毛等样品。5.1.2疑似样本的采集需要做好生物安全防护，样品的采集和包装应采用无菌器具，样本采集后应密封、冷藏并立即用最快的方式运送到实验室。5.1.3·以细菌培养诊断动物感染士拉杆菌时,样品的选择应以观察到的临床症状或剖检观察到病理变化为依据，最有用的样品包括肝、脾、骨髓、肾、肺、淋巴结和血液。土拉杆菌在低温条件下存活时间较 SN/T 1501—-2015长，阳光直射、紫外线、60℃高温和常规消毒剂可很快将其杀死，它们在产品不同部位的分布与特殊加工工艺造成的物理化学条件、包装运输保存条件等有关。5.1.4严重污染或含菌量少的样本，进行动物接种可提高检出率，但除非绝对必要，尽量避免使用动物试验。5.2显微镜检查5.2.1试剂3%盐酸酒精、结晶紫染色液、革兰氏碘液、沙黄复染液，配制方法见附录C。5.2.2主要设备和材料显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片。5.2.3试验程序涂片制备肝、脾、骨髓、肾、肺等组织样本压片，渗出液、血液等液体样本直接涂片，细菌培养物直接涂片。革兰氏染色涂片自然干燥后用3%盐酸酒精固定5min，水洗、干燥后作革兰氏染色镜检。滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。滴加革兰氏碘液，作用1.min；水洗。滴加95%乙醇脱色，约15 s～30 s,直至染液被洗掉，不要过分脱色，水洗。滴加沙黄复染液，复染 1min。水洗，风干，镜检。5.2.4结果判定土拉杆菌为革兰氏阴性菌，革兰