SN_T 4877.15-2019基因条形码筛查方法 第15部分：检疫性叶点霉.pdf

ICS 65.020.01B 16SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4877.15—2019基因条形码筛查方法第15部分：检疫性叶点霉DNA barcoding screening method--Part 15: Quarantine Phyllosticta spp.2019-09-03 发布2020-03-01实施羽出版社有限公司中华人民共和国海关总署HG944440021527发布活网址刮开涂层激活密码 SN/T 4877.15-2019前言SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为15个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；第2部分：检疫性黄单胞菌；-第3部分：检疫性植原体；-第4部分：检疫性茎点霉；-第5部分：检疫性拟茎点霉；-第6部分：检疫性嗜酸菌；第7部分：检疫性轮枝菌；第8部分：检疫性炭疽菌;第9部分：检疫性腥黑粉菌；第10部分：检疫性疫霉；第11部分：检疫性异株苋亚属；第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒；-第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒；第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒；第15部分：检疫性叶点霉。本部分为SN/T4877的第15部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：段维军、蔡磊、郭立新、陈倩、段丽君、李雪莲、刘芳、赵文军、陈先锋。 SN/T 4877.15—2019基因条形码筛查方法第15部分：检疫性叶点霉1范围SN/T 4877的本部分规定了检疫性叶点霉 DNA条形码筛查方法。本部分适用于进境植物及其产品中检疫性叶点霉的筛查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 2589植物病原真菌检测规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1检疫性叶点霉属真菌Quarantine Phyllosticta spp.葡萄苦腐病菌 Greeneria uvicola(Berk.et M.A.Curtis)PunithalingamL现用名为 Phyllosticta am-pelicida(Engelm.)Aa, 曾用名 Guignardia bidwelli(Ellis)Viala Ravaz 和 Phoma uvicola Berk.M.A.Curtis}。分类地位：叶点霉属（Phyllosticta）、球壳孢科（Phyllostictaceae）、葡萄座腔菌目（Botryo-sphaeriales）、座囊菌纲(Dothideomycetes）、子囊菌门（Ascomycota)。3.2凭证标本 voucher specimen一种为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等)而长期保存的标本，它可以是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质。凭证标本的保存需要有详细的标本编号、存放地点等信息，以便于日后查证。3.3DNA 条形码 DNA barcode生物体内能够代表该物种的,标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的 DNA片段。4　方法原理根据叶点霉属真菌的核糖体转录间隔区(ITS)的序列特征，应用 DNA条形码技术对检疫性叶点霉进行种类筛查,确定目标真菌是否为检疫性叶点霉及其种属归类。1 SN/T 4877.15--20195仪器用具和试剂5.1仪器设备与用具显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、组织破碎仪、恒温水浴锅、台式冷冻离心机、微量分光光度仪、电子天平、超纯水仪、旋涡振荡器、冰箱、微量移液器（0.5μuL、2.5uL、10 μL、20 μL、200 μL、1000 uL）、常规PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、DNA提取仪。5.2 主要试剂购置如下试剂或者相应的真菌基因组提取试剂盒：乙二胺四乙酸钠盐（Na2EDTA·2H2O）、氢氧化钠（NaOH）、Tris碱、浓盐酸（HCI）、溴化十六烷基三甲铵（CTAB）、氯化钠（NaCI）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、冰醋酸(CH:COOH）、蒸馏水、氯仿（CHCls）、异戊醇、70%乙醇。PCR 和电泳检测所需试剂：1O X PCR 缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ExTaq 聚合酶、引I物、超纯水、DL 2000 Marker、琼脂糖、GelRed 核酸凝胶染料。6筛查鉴定方法6.1样品的采集与处理样品的采集、分离、纯化和培养按照SN/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。6.2核酸的制备采用基因组提取试剂盒制备DNA,或采用改良的 CTAB提取法，参见附录 A。6.3D