病毒—病毒的培养技术（动物微生物课件）.pptxVIP

病毒的鸡胚接种 病毒培养的宿主：本动物（例如：猪瘟病毒-猪）实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、鸡胚体外培养的活细胞在本试验中，采用的是鸡胚接种、培养新城疫病毒。一、实验目的了解鸡胚的基本结构与功能；掌握新城疫病毒的鸡胚尿囊腔接种法。 二、试验原理 鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。 尿囊腔接种常用于流感病毒、新城疫病毒等的接种和培养。进入尿囊腔的这些病毒，能够在尿囊的内胚层细胞中大量繁殖，随后释放到尿囊液中。通过尿囊腔接种途径可获得大量的病毒。二、试验原理鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的组织和液体中含大量病毒。尿囊腔接种常用于流感病毒、新城疫病毒等的接种和培养。进入尿囊腔的这些病毒，能够在尿囊的内胚层细胞中大量繁殖，随后释放到尿囊液中。通过尿囊腔接种途径可获得大量的病毒。三、材料鸡新城疫病毒（NDV）、鸡胚（9-11日龄）、照蛋灯、蛋座、酒精棉球、碘酊棉球、酒精灯、打孔器、1mL注射器、石蜡、废物缸、孵卵箱四、鸡胚的结构与功能卵壳 上有细孔，进行气体交换壳膜 使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。气室 呼吸和调节压力绒毛尿囊膜 起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。尿囊腔 胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。在本试验中，病毒的鸡胚接种部位在尿囊腔。羊膜与羊膜腔 其中盛有羊水，胎体浸泡于其中卵黄 在胚胎发育早期供给鸡胚营养。卵白在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。10日龄鸡胚的结构 五、受精卵的选择最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响。受精卵的壳最好是白色的。受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。六、鸡胚孵育条件孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃相对湿度：50%-60%必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后。从孵育后第3天开始，每天翻蛋一次。七、鸡胚生长发育过程鸡胚从第1天开始孵育至第21天出壳，胚胎发育过程如图所示。孵育至第13天时，鸡胚开始长毛。在本试验中，使用的是9-11日龄的鸡胚。八、 照蛋检卵在发育的早期，鸡胚不易辨认，要到4－5天后才容易看见。因此，检卵要在孵育4－5天后进行，每天用照蛋灯检卵一次，检查鸡胚的存活情况。活胚：活的鸡胚绒毛尿囊膜界线较明显，上面的血管清晰可见、成网状，可看到明显的胚胎自主运动。死胚：血管模糊、变细、折断脱落，成淤血带或淤血块，没有胚动。发育至第4天的鸡胚发育至第5天的鸡胚活胚：血管清晰九、鸡胚尿囊腔接种新城疫病毒操作步骤1、选用9-11日龄的鸡胚，在黑暗环境下用照蛋灯检查鸡胚活力。活胚：发育良好的鸡胚可见清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动。死胚：血管昏暗模糊成淤血带或淤血块，没有胚动。 2、在照蛋灯的灯光下用铅笔画出气室范围，并在将要接种的部位做好记号。注意：接种部位须避开大血管，在气室边缘靠上方0.5cm左右位置。 图中黑色部分即尿囊腔，注射器针头从接种部位垂直插入尿囊腔内，注入病毒液。九、鸡胚尿囊腔接种新城疫病毒操作步骤3、用酒精棉擦拭蛋胚，置于消过毒的蛋托上。4、用碘伏和酒精消毒接种和气室部位。先用碘伏棉球消毒，1min后用酒精棉球消毒。5、将打孔器灼烧灭菌，稍冷后在接种部位打一小孔。注意：打孔器打孔时不能穿透蛋壳膜，避免造成污染。6、将装有新城疫病毒液的注射器沿小孔插入针头的三分之二左右，注入0.2ml病毒接种物。7、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育（温度37℃，相对湿度50%-60%）。8、每天翻卵并检卵一次，24h内死亡者废弃；24h之后死亡的鸡胚标记好死亡时间，如48h、64h、72h。将死亡的鸡胚置于 4℃冰箱过夜，待收毒。作业1.用于病毒培养的系统主要有哪些？2.简要说明鸡胚的结构及各部分结构的功能。3.如何区分死胚、活胚？4.用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题? 鸡胚收毒 一、实验目的掌握鸡胚收毒方法。掌握鸡胚收毒注意事项。二、材料已经接种病毒的SPF鸡胚；灭菌好的组织镊、眼科镊、眼科剪、带盖小青瓶、枪头（蓝色）；移液枪（1ml）、酒精灯、碘伏棉球、酒精棉球、蛋托、废物缸，标签纸三、新城疫病毒接种鸡胚后对鸡胚的影响新城疫病毒通过尿囊腔接种法接种于9-11日龄鸡胚之后，若接种的新城疫病毒是强毒株，鸡胚在接种后30-60h死亡；若接种的是弱毒株，鸡胚在接种后3-6d死亡。以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、足趾、翅膀出血最为明显。四、收毒前鸡胚处理--鸡胚冷置收获前鸡胚须气室朝上置于 4℃冰箱 6h 或过夜，但不能放置时间过长（过长会引起散