SNT 2532-2010贝类和水样中柯萨奇病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2532--2010贝类和水样中柯萨奇病毒检测方法普通 RT-PCR 方法和实时荧光RT-PCR方法Determination of Coxsackieviruses in shellfish and water-Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR2010-03-02发布2010-09-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局3801数码防伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准贝类和水样中柯萨奇病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光 RT-PCR方法SN/T 2532--2010中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www.spc. 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷￥开本880×1230　1/16　印张1字数24千字2010年5月第一版　2010年5月第次印刷印数 11 600书号：155066·2-20868 SN/T 2532-2010言前本标准附录 A为规范性附录、附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李想、杨捷琳、潘良文、黄一、卢钟山、张舒亚、吕蓉、刘月明、高琴、刘代新。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2532--2010贝类和水样中柯萨奇病毒检测方法普通 RT-PCR 方法和实时荧光 RT-PCR方法范围1本标准规定了贝类和水样中 B2、B3、B5、A9 和 A16型柯萨奇病毒普通 RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法。本标准适用于贝类和水样中B2、B3、B5、A9 和 A16 型柯萨奇病毒的定性检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3.2质粒标准分子plasmid reference molecule一种包含病毒特异性 cDNA 片段的重组质粒分子,可作为病毒 PCR 检测中的阳性对照。4　方法提要用合适的裂解液（如 Tri-reagent)提取贝类样品中病毒 RNA,并根据柯萨奇病毒 RNA 3末端含有Poly(A)的结构,用连接 Oligo(dT)25的磁珠特异性吸附柯萨奇病毒 RNA 进行纯化。对水样中的病毒进行富集后，采用合适的方法提取和纯化病毒 RNA。利用普通 RT-PCR或实时荧光 RT-PCR方法进行检测。本研究通过构建质粒标准分子(每个质粒分子包含1拷贝扩增片段），确定分别适于五种血清型柯萨奇病毒检测的普通 RT-PCR体系检测下限均为 50拷贝，实时荧光 RT-PCR体系检测下限均为 2拷贝。5 试剂所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。阳性标本：柯萨奇病毒，一80℃冰箱保存；或含柯萨奇病毒检测目的片段的质粒标准分子，5.1一20℃冰箱保存。5.2甘氨酸缓冲液：见附录 A.1.1。5.3PEG 8000 溶液:见附录 A.1.2。5.4裂解液：Tri-reagent 或其他等效裂解液（如：TRIzol)。5.5Oligo(dT)25磁珠:Dynabeads-oligo(dT)25或等效品。 SN/T 2532—20105.6　超纯水(无RNase 和 DNase 污染）:见附录 A.2.3。5.775%乙醇:见附录 A.2.4。5.8 三氯甲烷。5.9 异丙醇。5.101RNA吸附缓冲液:见附录 A.2.5。5.112XRNA吸附缓冲液:见附录 A.2.6。5. 12漂洗缓冲液：见附录 A.2.7。5.13PrimeScriptTM RT reagent Kit, TaKaRa,Cat. No. DRR037S.5.14 Blend Taq-Plus DNA 聚合酶及配套缓冲液和 dNTPs,ToYoBo,Cat.No.BTQ-201。5.15 Premix Ex TagTM（Perfect Real-Time}及配套-ROX-荧光校正试剂（50 X），TaKaRa,Cat. No.DRR039A.5.16引物和探针：根据表1和表的序列合成引物和探针，引物和探针加超纯水（无RNase和DNase污染）分别配制成10 μmol/L和5μmol/L储备液。