NY 908-2004羊干酪样淋巴结炎诊断技术.pdf

ICS 11.220B 42NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 908-2004羊干酪样淋巴结炎诊断技术Diagnotic technique for caseous lymphadenitis in sheep and goat2005-01-04 发布2005-02-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 908—2004前言本标准的附录 A、附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：西北农林科技大学。本标准主要起草人：张彦明、邢福珊。I NY/T 908-2004羊干酪样淋巴结炎诊断技术1范围本标准规定了羊干酪样淋巴结炎(caseous lymphadenitis in sheep and goat,简称 CLA)病原菌分离与鉴定和酶联免疫吸附试验2种检疫方法。本标准规定的病原菌分离与鉴定适用于羊于酪样淋巴结炎的诊断，酶联免疫吸附试验适用于羊干酪样淋巴结炎的诊断、检疫及流行病学调查。2病原菌分离与鉴定2.1 发病特征和病理变化发病羊的淋巴结肿大,呈脓性干酪性坏死,病羊消瘦,生产性能下降,孕羊产出死胎,严重者死亡。在发病羊的肺、肝、脾和子宫角发生大小不等的结节,内含淡黄色干酪样物质。2.2培养基鲜血琼脂,血清琼脂,葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、淀粉、蕈糖发酵培养基，含0.2%吐温-80的马丁肉汤，成分和制备方法见附录A。2.3病料的采取按无菌操作方法用18号以上的针头和注射器采取淋巴结中干酪样脓汁,作为病原菌分离与鉴定的病料。2.4分离培养2.4.1将采取的脓汁接种于鲜血平板或血清平板,37℃培养24h,观察菌落生长情况。2.4.2若在血液琼脂平板上出现黄白色、不透明、凸起、表面无光泽的菌落，初分离时菌落周围有狭窄溶血环,则判为可疑菌落。2.4.3若在血清琼脂平板上出现细小的颗粒样、半透明、边缘不整齐、干燥、松脆的菌落，则为可疑菌落。2.4.4将上述可疑菌落涂片，用革兰氏染色法染色、镜检。若见有革兰氏阳性、呈球形或细丝状、一端或两端膨大呈棒状的细菌,排列不规则，常呈丛状或栅栏状,则为可疑伪结核棒状杆菌,需进一步做生化试验。2.5生化试验将可疑菌落纯培养后,接种于2.2中的各种糖发酵培养基试管中,37℃培养 24 h,若葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖发酵产酸不产气，而淀粉、蕈糖不发酵,则判定为伪结核棒状杆菌。3酶联免疫吸附试验(ELISA)3.1抗原制备见附录 B.1。3.2各种液体的配制见附录 B.2～B.63.3酶标抗体和血清3.3.1酶标兔抗羊 IgG购买酶标兔抗羊IgG,用时以稀释缓冲液作1:4000稀释。1 NY/T 908—20043.3.2阴性血清、阳性血清和待检血清的制备血清的分离方法用无菌操作法从羊的颈静脉采取5mL血液于洁净的灭菌小瓶内，盖上瓶塞,倾斜静置,待析出血清后,用灭菌巴氏管将血清吸至另一洁净的灭菌小瓶内,置－20℃冰箱保存,保存期6个月,用时融解并作1:40稀释。阴性血清的制备将临床上健康、伪结核棒状杆菌菌体凝集抑制试验检测结果为阴性的临产前山羊当作未受伪结核棒状杆菌感染的羊只,剖腹产后,采其胎羔心脏血液分离的血清作为阴性血清。阳性血清的制备将伪结核棒状杆菌参考菌株（ATCC19410株)人工感染羊，感染羊临床上出现症状,30d后，从肿大的淋巴结中可分离到与感染菌相同的病原菌,采其血液分离的血清作为阳性血清。待检血清的制备从随机抽样的待检羊所采血液分离的血清作为待检血清。3.4操作方法3.4.1在酶标板内加抗原50μL/孔（设立2孔空白对照,不加抗原）,在4℃冰箱中过夜。3.4.2取出酶标板，甩出孔内液体，每孔用洗涤液(本方法中用稀释缓冲液作为洗涤液)200μL，甩出孔内液体,反复5次,最后-一次甩出孔内液体后在吸水纸上将孔内水分拍干。3.4.3加了抗原的孔加1%BSA50μL/孔（封闭），置37℃温箱1h。洗涤酶标板（方法同3.4.2)。3.4.4在加了抗原的孔中加血清50μL/孔(2孔阳性血清和2孔阴性血清作对照,其他孔加待检血清各2孔）,置37℃温箱1h。洗涤酶标板(方法同3.4.2)。3.4.5加酶标兔抗羊IgG50μL/孔，置37℃温箱1h。洗涤酶标板（方法同3.4.2)。3.4.6加底物溶液50μL/孔，置37℃温箱显色15min，取出，每孔加终止液50μL,混匀后用酶标仪测OD492 值。3.5判定方法用 P/N 值进行判定。P(Positive)即阳性血清或待检血清平均 OD值,N(Negative)即阴性血清平均OD值。若 P/N2,则判为阳性;若 P/N≤2,则判为阴性。阳性对照孔 P/N值必须大于2,否则试验无效。2 NY/T 908—2004附录A(规范性附录)病原菌分离与鉴定培养基的成分和制备