SNT 2055-2008豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2055—2008豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法Identification of cowpea severe mosaic virus2008-04-29发布2008-11-01实施中华人民共和国发布康层 1810线查询氧优国家质量监督检验检疫总局、数码防伪、 SN/T 2055-2008前言本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李桂芬、李明福、魏梅生、张永江、相宁、王金花。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2055--2008豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法。本标准适用于可能带有豇豆重花叶病毒的进境种苗或繁殖材料的检疫和鉴定。2 原理豇豆重花叶病毒学名：cowpeasevere mosaic virus,缩写:CPSMV。豇豆重花叶病毒的生物学、血清学特性是本标准制定的主要依据；该病毒的分类地位、寄主范围病害症状、地理分布、传播途径、粒体形态等参见附录A。3仪器和用具3.1仪器3.1.1酶标检测仪。3.1.2 天平(0.001 g)3.1.3水浴锅。3.1.4隔离温室。3.2用具3.2.1可调移液器、可调移液器吸酶联板。.3Eppendorf 管。3.2.4研钵。检疫鉴定方法44.1豆类种子检测前的处理应将种子播种在经高温消毒过的土壤中，置隔离温室中培养并观察生长情况，待长有6片～8片真叶时进行检测。首先选择可疑病毒症状植株进行检测，同时也要随机抽取植株样品进行检测。4.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定法4.2.1试材酶联板使用质量有保障厂商生产的酶联板。包被抗体特异性好的抗豇豆重花叶病毒抗体。酶标抗体碱性磷酸酶标记的抗豇豆重花叶病毒抗体。包被缓冲液(pH9.6)1.59 g碳酸钠（Na2CO3）2.93 g碳酸氢钠（NaHCO3）0.20 g叠氮化钠（NaN3） SN/T 2055—2008用蒸馏水定容至1L，4℃储存。洗涤缓冲液(PBST、pH7.4)氯化钠(NaCI)8.0g磷酸二氢钾（KH2PO）0.2 g1.15 g磷酸氢二钠(Na2HPO4）0.2g氯化钾(KC1)0.5 mL吐温-20(Tween-20)0.2g叠氮化钠（NaN3）用蒸馏水定容至 1 L。样品抽提缓冲液1.3g亚硫酸钠（Na2SO3）20 g聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MV24000～40000)用洗液(PBST)定溶至 1 L,4℃储存。酶标抗体稀释缓冲液20g聚乙烯基吡咯烷酮(PVP，MV24000～40000)2g牛血清白蛋白(BSA)用洗液(PBST)定溶至 1L，4℃储存。底物缓冲液97 mL二乙醇胺(C4 H11 NO2）600 mL蒸馏水(H2O)用盐酸(HCl)调 pH 值至 9.8,然后用蒸馏水定容至 1L,4℃储存。4.2.2 实验步骤按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100μL。酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在37℃孵育.2h。清空酶联板孔中溶液，用PBST加满各孔，3min后倒掉孔中洗涤液，在吸水纸上拍干。再重复2次上述洗板过程。待检样品按1：（2～10)（质量浓度）加人样品抽提缓冲液，在研钵中研磨，低速离心，吸取上清液加入到酶联板孔中（100uL/孔），每个待检样品设2个重复，设阳性对照孔、阴性对照孔、缓冲液对照孔。加盖或用保鲜膜包好，4℃冰箱孵育过夜。清空孔中溶液，先在自来水下彻底冲洗3次；然后用PBST加满各孔，3min后倒掉，在吸水纸上拍于。再重复2次上述用PBST的洗板过程。按要求的浓度用酶标抗体稀释缓冲液稀释酶标抗体，每孔加入100uL，加盖或用保鲜膜包好,37℃孵育 4 h。清空孔中溶液，先在自来水下彻底冲洗3次；然后用PBST加满各孔，3min后倒掉，在吸水纸上拍干。再重复2次上述用PBST的洗板过程。按1mg/mL的浓度将对硝基苯磷酸二钠盐溶于底物溶液中（使用前配制并注意避光以防变色）制成底物溶液。每孔加人100μL底物溶液。加盖或用保鲜膜包好，室温避光孵育至颜色合适时读数。酶标检测仪405nm波长下测定各孔的吸收值。4.2.3结果判定对照孔的OD405值缓冲液孔、阴性对照孔及阳性对照孔)应该在质量控制范围内，即：缓冲液2 SN/T 2055--2008孔和阴性对照孔的OD405值小于0.15，当阴性对照孔的OD405值小于0.05时，按0.05计算；阳性对照OD405值/阴性对照OD405值大于5;孔的重复性一致。在满足了质量要求后，结果可判定如下：样品OD405值/阴性对照OD405值大于或等于 2,判为阳性。必要时需要重复做一次酶联实验，以便排除假阳性