SN_T 4050-2014鲍鱼疱疹病毒感染检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4050--2014鲍鱼疱疹病毒感染检疫技术规范Quarantine Protocol for infection with abalone herpesvirus2015-05-01实施2014-11-19发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局查真 SN/T 4050—2014前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：赵玉然、尹伟力、蒋玉婷、郑晓聪、孙明君、郑小龙、何俊强、于力、王津津、岳志芹。I SN/T4050—2014鲍鱼疱疹病毒感染检疫技术规范1范围本标准规定了鲍鱼疱疹病毒感染的临床诊断、病理组织学方法和分子生物学方法。本标准适用于鲍鱼疱疹病毒感染的诊断和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193基因检验实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。AbHV：鲍鱼疱疹病毒（Abaloneherpesvirus）BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate）Ct值：荧光信号达到设定的阈值所经历的扩增循环次数（Cyclethresholdvalue）EDTA:乙二胺四乙酸（EthyleneDiamine Tetraacetic Acid)NBT：氯化硝基四氮唑蓝（NitrotetrazoliumBluechloride）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction)SDS：十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecyl sulfate）4试剂和材料4.1水：符合GB/T6682中三级水的规格。4.2苏木精。4.33伊红。4.4引物：见表1。表1引物序列序列名称5*-TCC-CGG-ACA-CCA-GTA-AGA-AC-3AbHV ORF66F15-CAA-GGC-TGC-TAT-GCG-TAT-GA-3AbHV ORF66R15-6FAM-TGG-CCG-TCG-AGA-TGT-CCA-TG-TAMRA-3AbHV 66Prb11 SN/T 4050—2014表1 (续)名称序列AbHV ORF77F15-CAA-CCA-CTT-GTT-CGG-GTT-CT-3AbHVORF77R15-CAG-GGT-GAT-TAA-TGC-GGA-GT-3*AbHV 77Prbl5-6FAM-TCC-GTA-CGC-GGG-ATC-TTC-GT-TAMRA-318SF15-CGG-CTA-CCA-CAT-CCA-AGG-AA-318SR15-GCT-GGA-ATT-ACC-GCG-GCT-318SPrb5°-6VIC-TGC-TGG-CAC-CAG-ACT-TGC-CCT-C-TAMRA-3AbHV-165-GGC-TCG-TTC-GGT-CGT-AGA-ATG-3 *AbHV-175-TCA-GCG-TGT-ACA-GAT-CCA-TGT-C-3AbHV ORF66f15-TCC-CGG-ACA-CCA-GTA-AGA-AC-3AbHV ORF66r25*-GCC-GGT-CTT-TGA-AGG-ATC-TA-34.5EDTA。4.6SDS.4.7蛋白酶K见附录A。4.8TagManFastUniversalPCRMasterMix实时PCR反应液预混液（含热启动DNA聚合酶，buff-er,UNG酶)。4.9Taq聚合酶预混液（含Taq酶，Mg²+，dNTP,缓冲液）。4.10地高辛标记试剂盒。5仪器设备与检测环境要求5.1切片机。5.2显微镜。5.3PCR扩增仪。5.4水平电泳仪。5.5实时PCR仪。5.6检测实验室符合GB19489的要求。6样品采集参照GB/T18088规定进行，样品采集出现疑似临床症状的样品或濒死的样品。7检测方法7.1临床症状观察患病个体的临床症状主要表现为鲍鱼活力很低，无食欲，怕光，生长速度变慢，粘液增多，足变黑变硬，口部肿胀和突出，踏板肌肉活力下降，足边缘向内卷曲，导致暴露出清洁光亮的壳，死亡的鲍显示肝胰腺和消化道肿大(参考附录B)。2 SN/T 4050—20147.2显微镜观察7.2.1取样用灭菌剪刀活体解剖取脑和神经节等神经组织。7.2.2固定迅速将组织切成厚度不超过3mm的组织块，