SN_T 3990-2014蜜蜂囊状幼虫病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3990—2014蜜蜂囊状幼虫病检疫技术规范Quarantine protocol for sacbrood disease of bees2014-11-19发布2015-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局a刮涂层查真价 SN/T3990-2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郑腾、张体银、李宋钰、张志灯、宋战昀、王武军、白泉阳、王伟利。I SN/T3990—2014蜜蜂囊状幼虫病检疫技术规范1范围本标准规定了蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断方法和实验室诊断方法。本标准适用于蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断与检疫鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3临床诊断3.1箱外观察法当蜜蜂外出活动采集时，可看到蜜蜂从巢箱内拖出病死幼虫，在蜂箱前也可观察到零散的死亡幼虫，则需进一步对蜂群进行检查3.2蜂群检查法打开蜂箱观察封盖子脾，检查是否存在死亡幼虫比健康幼虫多的现象。由于发病初期病虫不断被工蜂清除，因此脾面上会出现卵、小幼虫、大幼虫、封盖子排列不规则的现象，即所谓“花子脾”现象（参见图A.1）。但病害严重时，病虫多，工蜂清理不及，可以在脾面上见到病虫巢房被工蜂咬开，巢房盖有大量不规则孔洞，露出患病幼虫上翘的头部呈“尖头”状，其头部有大量的透明液体聚积。用镊子小心夹住幼虫头部将其提出，可见虫体末端明显的囊状袋，虫体苍白色、无味、无黏性（参见图A.2）。死虫逐渐由乳白色变褐色，当虫体水分蒸发后，会干燥成黑褐色的鳞片，头尾部略上翘，形如“龙船状”。死虫体不具黏性、无臭味、易清除。通过检查幼虫和封盖子脾，可以依据以上特征性病变做出初步诊断。如需进-步确诊，可进行实验室诊断。3.3鉴别诊断在临床诊断时应注意将本病与美洲幼虫腐臭病相区别。美洲幼虫腐臭病又称为“烂子病”，是由幼虫芽孢杆菌引起的一种幼虫的细菌性传染病，和囊状幼虫病有相似之处，它们都是引起封盖后的幼虫大量死亡，但这两种疾病各有特点，应注意区别（见表1）。1 SN/T 3990-2014表 1蜜蜂囊状幼虫病与美洲幼虫腐臭病临床诊断时的区别要点病种病原发病时间死亡虫体特征枯干后呈褐枯干后易与囊状幼虫病病毒无臭味无黏性封盖子发病色龙舟状巢房分离腐败、鱼黏性强，用锻子枯干后不易细菌美洲幼虫腐臭病封盖子发病黑色鳞片样腥臭味可拉成细丝与巢房分离4实验室诊断4.1设备、材料和试剂4.1.1设备梯度PCR扩增仪。台式冷冻高速离心机。微量移液器（100μ～l000u20μ～200μl，2μ～20μ0.5μ~10μL）。电泳系统。凝胶成像仪系统。电子天平（感量0.01g）。防护用具（包括蜂帽、防蛰手套、养蜂工作服和喷烟器）。4.1.2材料和试剂普通RT-PCR检测用引物（对）序列为：F15-ACC AACCGATTC CTC AGT AG-3R15-CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA-3扩增片段约469bp。焦炭酸二乙酯处理水(DEPC水）。无水乙醇。脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）。琼脂糖（电泳纯）。溴化乙锭（10mg/mL）。分子量标准（100bp～1000bp）。电泳缓冲液。加样缓冲液。0DNA纯化回收试剂盒。1RNA抽提、反转录和PCR扩增可以采用等效的提取方法或试剂盒。2蜜蜂囊状幼虫病病毒标准株，由指定单位提供。3试验用水应符合GB/T6682中三级水的规格要求。4.2采样、送样和处理4.2.1幼虫样品的采集和处理如果蜂群有典型的临床症状，可以无菌割取一小块带有病虫或死虫的巢脾，也可无菌挑取单个病虫2 SN/T3990--2014或死虫若干只装入无菌的小试管内，供检测用。如果蜂群没有典型的临床症状，可以随机无菌挑取幼虫若于只分别装人无菌的小试管内，供检测用。4.2.2成蜂样品的采集和处理如果蜂群有典型的临床症状，可以用灭菌后的镊子挑取蜂群内巢脾上或蜂箱底部带有典型病状的蜜蜂，以及在蜂箱前爬行的垂死蜜蜂和死亡蜜蜂20～30只，分别装人无菌的小试管内，供检测用。4.3操作步骤4.3.1RNA提取RNA提取按QIAGEN1公司的RNA抽提试剂盒（RneasyMiniKit)进行。选取不超过30mg待鉴定虫体或蜂体，置于DEPC处理过的研钵中，加人液氮进行研磨，将研磨得到的粉末，快速转移至无RNase并经过液氮冷却的1.5mL离心管中。加人600μL缓冲液RLT，颠倒混匀，高速涡旋振