SN_T 5126-2019鲑鱼及其加工产品中转基因成分定性PCR检测方法.pdf

ICS 65.020.30B 41SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5126—2019鲑鱼及其加工产品中转基因成分定性PCR 检测方法Method of polymerase chain reaction for detecting genetically modified salmonsand their derived products2019-09-03 发布2020-03-01实施中国海南出版社有限公司中华人民共和国海关总署HG944440004855发布收活网址：ww刮开涂层微活密码 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准鲑鱼及其加工产品中转基因成分定性PCR 检测方法SN/T 5126-2019中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023）编辑部：(0107509网址 /book中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.5字数14千字2020年3月第一版　2020年3月第次印刷印数 1—500*书号：155175·185 SN/T 5126—2019言前本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国黄埔海关。本标准主要起草人：王勤、刘晓飞、王慧煜、李霆、林祥梅、付伟、李想、刘二龙、黄文胜、李晓琳、仇松寅、刘丹丹、梅琳。 SN/T 5126—2019鲑鱼及其加工产品中转基因成分定性PCR 检测方法1 范围本标准规定了大西洋鲑AAS及其产品中转基因成分荧光PCR检测方法。本标准适用于大西洋鲑AAS 及其产品中转基因成分(GH-AFP)的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T27403实验室质量控制规范　食品分子生物学检测3 缩略语下列缩略语适用于本文件。AAS:转基因大西洋鲑(AquAdvantage Salmon)AFP:抗冻蛋白(antifreeze protein)GH:生长激素(growth hormone)4操作方法4.1主要仪器4.1.1荧光 PCR仪。4.1.2超净工作台。4.1.3台式冷冻离心机。4.1.4涡旋振荡器。4.1.5恒温水浴锅。4.1.6-80℃冰箱或液氮罐。4.2主要试剂除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，实验用水为双蒸水。4.2.1 蛋白酶K。4.2.2 乙酸钾。4.2.3三氯甲烷：异戊醇,24：1。4.2.4酚：三氯甲烷：异戊醇，25：24：1。 SN/T 5126—20194.2.5十二烷基磺酸钠(SDS)。4.2.6 TE缓冲液。4.2.7 乙醇。4.2.8 冰乙酸。4.2.9氢氧化钾。4.2.10探针法预混液（2×）。4.3引物和探针引物和探针序列见表1，扩增参考序列见附录A。表 1检测转基因鲑鱼外源基因所需的引物及探针序列被检测基因备注引物序列探针序列TCCGAGCAGCAAAGCC_上游:5’CATCTCCAGGGTICGGTITCC3GH-AFP外源基因ATGTAGCAAAGAC下游:5’CGTGGCATACACAGAGTGAGC3上游:5’ CACAGGGGAGCCAGGATG 3TGAGCCTGGATGACAAGH内参基因下游:5’CAGGTTCTGGTAGTAGTTCCCGTAG 3TGACTCTCAG4.4样品采集及核酸提取4.4.1样品采集无菌采集鱼肉组织作为检测样品，将其放人无菌离心管中，编号备用。4.4.2样品存放采集的样品放置在-80℃冰箱或液氮中保存，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。4.4.3核酸的提取采用GB/T19495.3--2004中A.1.5酚三氯甲烷-1法提取核酸，也可采用其他等效的商业化试剂盒。4.5荧光 PCR扩增4.5.1阴性对照、阳性对照和空白对照的设立阴性对照:非转基因大西洋鲑基因组 DNA。阳性对照:转基因大西洋鲑(AAS)基因组 DNA 或包含外源基因和内参基因片段的质粒 DNA。空白对照：以双蒸水代替DNA模板。4.5.2荧光PCR反应体系荧光PCR反应体系见表2，每个样品各做两个平行管。盖紧管盖，500r/min离心30s。2 SN/T 5126—2019表 2 荧光 PCR 反应体系试剂名称体积/μL探针法预混液(2×)10.0上游引物(10pmol/μL)0.6下游引物(10 pmol/μL)0.6探针(10 pmol/μL)0.6DNA 模板(50 ng/μL~100 ng/μL)1ROX荧光校正