SN_T 3686-2013白蜡树黄化植原体检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3686--2013白蜡树黄化植原体检疫鉴定方法Detection and identification of Candidatus Phytoplasma fraxini2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T3686-2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘鹏、赵文军、廖芳、赵卫东、牛春敬、郭京泽、王金成、李鑫、黄国明。 SN/T3686—2013白蜡树黄化植原体检疫鉴定方法1范围本标准规定了白蜡树黄化植原体的检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境白蜡树苗木中白蜡树黄化植原体的检疫鉴定。2原理2.1分类地位fraxini，Ash-yellowsphytoplasma），软壁菌门白蜡树黄化植原体（CandidatusPhytoplasma（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma）16Sr\植原体组。2.2鉴定方法白蜡树黄化植原体的分子生物学特性作为本标准鉴定方法的主要依据，本标准应用植原体分类鉴定软件(iPhyClassifier),得到特异性的植原体核糖体16SrDNA序列限制性内切酶模拟指纹图谱，该软件提供的模拟酶切图谱作为鉴定的依据。3仪器、用具和试剂3.1仪器PCR仪、超净工作台、高压灰菌锅、制冰机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统。3.2用具可调移液器（20μL、200μL、1000iL)及相关吸头、研钵、离心管（2mL)、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等。3.3试剂3.3.1研磨液Na2 HPO40.1 mol/LNaH,PO40.03mol/LEDTA10mmol/L(pH8.0)蔗糖10%（质量浓度）聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-402%（质量浓度）调整pH至7.6，然后过滤除菌。使用前加人0.15%（质量浓度）牛血清白蛋白（BSA)和1mmol/1.维生素C。1 SN/T3686—20133.3.2CTAB缓冲液CTAB2%（质量浓度）Tris-HCl100mmol/L(pH8.0)EDTA20 mmol/L(pH 8.0)NaCl1.4 mol/1PVP-401%（质量浓度）3.3.3其他试剂苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、引物等。4检测鉴定方法4.1症状观察现场对白蜡树苗木进行观察，症状描述参见附录A，挑取可疑症状植株样品带回实验室检测。4.2植原体DNA提取方法取0.3g组织（树根韧皮部组织，可选取叶脉和叶柄)放于研钵中，加入3mL预冷研磨液并研磨，将粗汁液转移至2mL离心管中，4℃下4500r/min离心5min，将悬浮液转至新的2ml离心管中.4℃下13000r/min离心15min，去掉上清液，在750μl预热（55℃）CTAB缓冲液中悬浮沉淀，55℃下育30min，间歇颠倒混匀，离心管在冰上冷却30s，加人750μl，三氯甲烷：异戊醇（24：1体积比），涡旋振荡，4℃或室温下13000r/min离心4min。小心将上面水相转至一个新的1.5mL离心管中，加人1体积预冷异丙醇，涡旋振荡，冰上孵育4min后4℃或室温下13000r/min离心10min，去掉上清液，用500μL70%（体积分数）冷乙醇洗涤DNA沉淀，4℃或室温下13000r/min离心1min，干燥DVA沉淀，用20μL灭菌蒸馏水悬浮沉淀，55℃下孵育离心管10min有助于DNA再悬浮，-20℃短期贮存或一80℃长期贮存。注：植原体基因组DVA提取方法也可采用商品试剂盒提取。4.3通用引物PCR扩增及序列测定用2对通用引物进行巢式PCR反应及凝胶电泳检测，扩增植原体16SrDNA序列，方法见附录B。4.4序列分析鉴定将第二轮PCR产物（引物R16fn/R16rn)进行序列测定，序列与Genebank上已知的白蜡树黄化植原体序列进行比对。4.5RFLP分析应用软件（iPhyClassifier)对植原体16SrDNA序列进行分析.软件原理为以17种限制性内切酶AluI,BamHI,BfaI,BstUI,DraI,EcoRIHaeI,HhaI,HinfIHpaI,HpaII,KpnIMboI，MseI，RsaI，SspI，TaqI对白蜡树黄化植原体的16